Microarray di DNA: differenze tra le versioni

Versione delle 18:18, 14 mag 2007

Versione delle 21:38, 27 lug 2007

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Per studiare gli mRNA, essi vengono prima estratti dalle cellule, convertiti in cDna, con l’uso di un enzima chiamato [[transcriptasi inversa]] e allo stesso momento marcati con una sonda fluorescente. Quando si fa avvenire l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il cDna target, quest'ultimo rimarrà legato alla sonda e può essere identificato semplicemente rilevando la posizione dove è rimasto legato.

Le principali applicazioni dei microarray sono l'analisi dei polimorfismi SNP, il confronto di popolazioni di RNA di cellule diverse e l'utilizzo per nuove metodologie di sequenziamento del Dna, nonchenonché per lo screening di sequenze senso e antisenso nella ricerca degli [[oligonucleotidi]] usati in campo farmaceutico.

Il segmento di DNA legato al supporto solido è noto come [[probe]]. Migliaia di probe sono usati contemporaneamente in un array. Questa tecnologia è nata da una tecnica più semplice nota come [[Southern blotting]], dove frammenti di DNA attaccati ad un [[substrato]] sono testati da sonde geniche aventi sequenze conosciute. La misura dell’espressione genica mediante microarrays ha un notevole interesse sia nel campo della ricerca di base che nella diagnostica medica, in particolare di malattie a base genetica, dove l’espressione genetica di cellule sane viene comparata con quella di cellule affette dalla malattia in esame.

==Produzione==

I microarraysmicroarray possono essere fabbricati usando diverse tecnologie, come la stampa di micro solchi, con un particolare microspillo appuntito su una lastrina di vetro dove verrà attaccata covalentemente la sonda (probe) di materiale genetico ottenuta per clonazione sfruttando la tecnica PCR, ([[fotolitografia]]); usando maschere preformate da ditte specializzate. [http://genomebiology.com/2004/5/8/R58].

Ogni singolo clone viene posizionato nell'esatta locazione sul vetrino da un robot. È evidente che questa tecnica richiede apparecchiature robotiche molto sofisticate.

Il nucleo dell'apparecchiatura è costituito da una "gruppo scrivente" che preleva uno più campioni di cDna mediante l'utilizzo di pennini e li trasferisce su vetrini per microscopio, il movimento è ovviamente controllato da un computer. Durante la deposizione il sistema di controllo del robot registra automaticamente tutte le informazioni necessarie alla caratterizzazione ed alla completa identificazione di ciascun punto della matrice. Una volta che la sonda è sul vetrino si effettua il processing, il passaggio cioè in cui la sonda viene legata covalentemente al supporto attraverso una reazione innescata dall'irraggiamento con luce ultravioletta o incubando il vetrino a 80 °C per 2 h. Infine il cDna viene reso a singola catena attraverso una denaturazione termica o chimica. Con questa tecnica però era possibile creare solo microarray a bassa densità (ovvero con poche sonde per mm quadrati).

I DNA microarraysmicroarray possono essere usati per rivelare RNA che può essere o non essere tradotto in proteine. Gli scienziati chiamano questa analisi [[espressione genica |"analisi dell’espressione"]] o [[profilo d’espressione]]. Con la tecnologia dei microarraysmicroarray si possono avere decine di migliaia di risultati in pochissimo tempo. Per questo motivo questa tecnologia ha permesso notevoli accelerazioni in diversi campi di investigazione biochimico e biotecnologico.

L’uso di microarraysmicroarray per lo studio del profilo d’espressione genetica è stato pubblicato per la prima volta nel 1995 (''[[Science (journal)|Science]]'') e il primo genoma eucariotico completato con analisi di microarray fu quello del ''[[Saccharomyces cerevisiae]]'' nel 1997 (''Science'').

===Array per fotolitografia===

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Il principale problema dei microarray e la mancanza di standardizzazione, che causa difficoltà nel confronto di dati; inoltre, se oggi con questa tecnica è possibile analizzare i livelli di espressione di un singolo gene ottenendo degli ottimi risultati, la combinazione dello studio di molte migliaia di geni risulta molto complicato e può portare spesso a dei falsi positivi, questo accade anche a causa del fatto che alcuni cDna possono cross-ibridare altre sonde (che avrebbero dovuto rilevare altri geni).

Un altro problema è presentato dai fluorofori, che nonostante siano molto simili fra loro presentano delle differenze problematiche. Esiste una diversa efficienza di fluorescenza tra Cy3 e Cy5 che deve essere standardizzata dai software di rilevazione, inoltre poiché Cy3 è più piccolo di Cy5, c'è un diverso livello di incorporazione del due fluorofori, in quanto la polimerasi presenta più difficoltà a inserire il nucleotide marcato con Cy5 a causa dell'ingombro sterico; come se non bastasse Cy5 si presenta più labile di Cy3, quindi una prima scansione di Cy3 con il laser potrebbe ridurre la fluorescenza di Cy5.

Per ovviare a tutte questa problematiche e per creare un minimo di standardizzazione si effettua il Diedye swap: consiste nel effettuare un secondo microarray scambiando l'uso dei fluorofori. Se nel primo microarray Cy3 è stato usato per marcare il cDna sperimentale, nel secondo microarray si userà Cy3 per marcare il cDna del soggetto di controllo, e viceversa per Cy5.

===Spotted microarrays===

Negli '''spotted microarrays''' (o ''' microarraysmicroarray a doppio canale'''), I probe sono oligonucleotidi, [[cDNA]] o piccoli frammenti prodotti con la tecnologia [[PCR]] corrispondenti a [[RNA messaggero|MRNA]]. Questo tipo di microarray sfrutta l’ [[ibridazione di DNA]] con cDNA da due campioni comparati (es. paziente e controllo), che sono marcate con due differenti fluorofori. I campioni possono essere miscelati e ibridizzati in un singolo microarray e quindi analizzati, permettendo la visualizzazione dei geni up-regolati e down-regolati contemporaneamente. Con questa tecnica il livello assoluto dell’espressione genica non può essere apprezzata a pieno, ma il costo dell’analisi è ridotto della metà.

[[immagine:Microarray-schema.gif|centre]]

===Microarrays di oligonucleotidi===

[[Immagine:Affymetrix-microarray.jpg|thumb|right|200px|Due Affymetrix chips]]

Nei '''Microarrays di oligonucleotidi''' (o '''single-channel microarrays'''), i probe sono progetteti per riconoscere parti di sequenze di mRNA conosciute o predette. Vi sono matrici microarray di tal specie commercializzate da numerose ditte specializzate come [[GE Healthcare]], [[Affymetrix]], or [[Agilent]], esse contengono oligonucleotidi importanti per alcune analisi rutinariedi routine o addirittura grosse parti di genomi di vari esseri viventi; inoltre possono essere prodotte matrici ad hoc a richiesta al fine di soddisfare qualsiasi bisogno, per la ricerca o la diagnostica.

Arrays oligonucleotidici possono essere prodotti o per deposizione piezoelettrica dell’intera lunghezza dell’oligo, o per sintesi in situ (fotolitografia).

Arrays di lunghi oligonucleotidici sono composti da 60-meri (oligo costituiti da 60 basi), e sono prodotti con la tecnologia ink-jet printing su substrati di silicio. Arrays di corti oligonucleotidici sono composti da 25-meri or 30-meri e sono prodotti per sintesi fotolitografica su substrati di silicio (Affymetrix) o per deposizione piezoelettrica su matrici acrilammidiche (GE Healthcare). Più recentemente la NimbleGen Systems, ha sintetizzato nueve matrici dette Maskless Array che possono essere utilizzate in modo flessibile con nemerossissiminumerossissimi oligonucleotidi test (probe): I nucleotidi che formeranno gli oligonucleotidi sono dei nucleotidi modificati che presentano un gruppo protettore fotolabile, che finché è presente ne impedisce il legame all'oligonucleotide in crescita. Questo gruppo può essere allontanato con una fonte luminosa che permette ai nucleotidi di reagire. Si usano delle "maschere" per determinare quale nucleotidi in quale posizione devono essere attivati dalla luce. In questa maniera sequenze oligonucleotidiche specifiche possono essere costruite in posizioni predeterminate. Questa tecnica permette di preparare microarray ad alta densità.

Un Array standard può contenere più di 390000 pozzetti test (spots). Nuovi array sono in studio per la ricerca nel campo biochimico (vie metaboliche) o per la diagnosi e la prevenzione in campo medico. In particolare questa tecnica è importante per l’analisi del genoma di soggetti con malattie genetiche o che sono soggetti apotenzialia potenziali malattie familiari, come il diabete, malattie cardivascolaricardiovascolari o tumori familiari.

==Microarray di genotipi==

DNA microarraysmicroarray possono essere usati per lo studio di genotipi.

Gli '''SNP microarraysmicroarray''' sono particolari DNA microarraysmicroarray che sono usati per identificare i così detti tratti ipervariabili, ovvero quelle sequenze che variano da individuo ad individuo nell’ambito della stessa specie o in sotto popolazioni isolate geograficamente o socialmente. Arrays di oligonucleotide corti sono usati per identificare il [[polimorfismo di un singolo oligo nucleotide]] ([[single nucleotide polymorphisms]]) (SNPs), che si pensano responsabili della variazione genetica e della suscettibilità individuale a manifestare determinate malattie. I DNA microarraysmicroarray possono essere usati anche per la genotipizzazione ([[genotyping]]) che trova impiego nella medicina forense ([[esame del DNA]]), nella diagnostica e in una nuova branca della farmacologia la [[farmacogenomica]] che si propone di studiare la relazione tra diversità genetica e risposta ai farmaci, intendendo per risposta sia gli effetti terapeutici che quelli collaterali o avversi.

Questi SNP microarraysmicroarray sono usati per tracciare i profileprofili di mutazione somatica nelle cellule tumorali. L’amplificazone e la delezione a cui vanno soggette queste cellule possono essere investigate contemporaneamente ai microarraysmicroarray l’[[ibridazione gnomica comparativa]].

==MicroarraysMicroarray e [[bioinformatica]]==

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=== Analisi statistica ===

L’analisi di DNA microarraysmicroarray propone numerosi problemi di carattere [[statistico|statistica]], compresa la [[Normalizzazione (statistica)|normalizzazione]] dei dati.

Analizzando il metodo dei microarrymicroarray pare evidente che, il grande numero di geni presenti in un singolo array pone lo sperimentatore davanti ad un problema di test multiplo: anche se è estremamente raro e casuale ogni gene può dare un risultato falso positivo, un test effettuato su più geni è più sicuro che mostri un andamento scientificamente più probante.

Una differenza fondamentale tra i microarray e gli altri metodi di analisi biomedici tradizionali sta nella dimensione dei dati. Studi che contengono 100 analisi per paziente per 1000 pazienti possono essere considerati vasti studi clinici. Uno studio microarray di media vastità comprende diversi migliaia dati per campione su centinaia di campioni diversi.