Short interfering RNA: differenze tra le versioni

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[[File:SiRNA and RNAI english.png|thumb|upright=1.6|Una molecola di siRNA (A) ed il processo molecolare della [[RNA interference]] che la molecola è in grado di avviare]]

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Uno '''small interfering RNA''' (o '''short interfering RNA''', traducibile come ''breve RNA interferente breve''), comunemente conosciuto come '''siRNA''', è una molecolaclasse di molecole di [[RNA]] lungaa [[RNA a doppio filamento|doppio filamento]], lunghe tra i 2019 ede i 2521 [[nucleotide|nucleotidi]], in grado di svolgere numerosi ruoli biologici.

Più precisamente, gliI siRNA sono coinvolti anzitutto nel ''pathway'' della [[RNA interference]], che conduce alla inibizioneall'interferenza dell'[[espressione genica|espressione]] di singolispecifici [[gene|geni]] con sequenze nucleotidiche complementari, degradando l'mRNA dopo la trascrizione, in modo tale da non far avvenire la traduzione. Hanno un ruolo importante anche in altri processi legati alla RNAi, come alcuni meccanismi antivirali o nel modellamento della struttura della [[cromatina]].

IlSul meccanismo esatto di tutti questi processi si sta avendoconcentrando solola inricerca questi ultimiper annigiungere una caratterizzazione completa ed esaustiva. Gli siRNA furono inizialmente individuati dal gruppo di ricerca di David Baulcombe a [[Norwich]], come attori principali nel cosiddetto ''silenziamento genico post-trascrizionale'' nelle piante <ref> {{en}} [httphttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=10542148&query_hl=1&itool=pubmed_DocSum Hamilton AJ, Baulcombe DC, A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants, Science. 1999 Oct 29;286(5441):950-2]</ref>. SuccessivamenteIn seguito, nel [[2001]], siRNA sintetici sono stati utilizzati per indurre RNAi in cellule di mammifero da parte del gruppo di ricerca di Thomas Tuschl<ref> {{en}} [httphttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=11373684&query_hl=3&itool=pubmed_docsum Elbashir SM ''et al'', Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8]</ref>. Queste scoperte hanno portato ada un interesse crescente per la RNAi e le sue possibili applicazioni in ricerca ed in clinica.

==Struttura==

[[ImageFile:SiRNA english.png|thumb|370pxupright=1.7|In una tipica molecola di siRNA i 19 nucleotidi centrali sono appaiati, mentre i due posti all'estremità sono sporgenti]]

Gli siRNA hanno una struttura ben definita, che consiste in un breve RNA a doppio filamento (RNAds), composto solitamente di 21 [[nucleotide|nucleotidi]], con due nucleotidi sporgenti ad ognuna delle due estremità 3'. Questa struttura è il risultato del processamento dell'[[enzima]] [[Dicer]], che converte lunghe molecole di RNAds o [[shRNA]] (molecole di RNA che formano una forcina) in siRNA <ref> {{en}} [httphttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=11201747&query_hl=6&itool=pubmed_docsum Emily Bernstein ''et al'', Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 409, 363-366 (18 January 2001)]</ref>. Gli siRNA possono essere introdotti artificialmente dall'esterno attraverso specifici metodi di trasfezione, per indurre il [[Silenziamento genico|silenziamento]] di geni specifici. In linea teorica, qualsiasi gene la cui sequenza sia nota può essere scelta come bersaglio di un siRNA. Questo ha reso gli siRNA uno strumento importante per studi sulla funzione genica e sullo sviluppo di nuovi farmaci.

==Induzione di RNAi attraverso siRNA o suoi precursori==

[[ImageFile:DICER.jpg|thumb|upright=1.3|L'enzima Dicer]]

La trasfezione di un siRNA esogeno può essere problematicoproblematica, dal momento che il silenziamento genico è solo transiente, soprattutto in cellule a rapida crescita. Una modalità per superare questo problema consiste nell'introduzione nella cellula bersaglio di un [[vettore (biologia)|vettore]] (come un [[plasmide]]) in grado di esprimere la molecola di siRNA desiderata. Ciò è possibile attraverso il ''design'' di vettori in grado di produrre molecole di RNAds contenenti una forcina (chiamati shRNA, ''small hairpin RNA''): tali molecole hanno il vantaggio di essere [[trascrizione (biologia)|trascritte]] esattamente come ogni altro RNA. Questi vettori sono infatti in grado di trascrivere gli shRNA attraverso [[promotorePromotore (biologia)|promotori]] [[eucariote|eucariotici]] specifici per la [[RNA polimerasi III]] (come U6il opromotore del gene umano H1, che codifica per un RNA catalitico, o il promotore dello [[snoRNA]] U6), che solitamente inducono la trascrizione dei piccoli RNA nucleari (o snRNA, dall'inglese ''small nuclear RNA'') coinvolti nello [[splicing]]. H1 is the [[Ribonuclease|RNase]] component of human RNase P). Gli shRNA risultanti dalla trascrizione vengono processate a siRNA dalla [[RNAsi]] [[Dicer]], anche se il reale coinvolgimento di [[Dicer]] in questo passaggio non è ancora confermato dall'intera comunità scientifica<ref>{{en}} [https://www.nature.com/nbt/journal/v23/n2/abs/nbt1051.html Kim DH ''et al'' Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nature Biotechnology 23, 222 - 226 (2004)]</ref>.

== Attivazione RNA ==

È stato recentemente scoperto che il dsRNA può anche attivare l'espressione genica con un meccanismo che è stato definito "attivazione genica indotta da small RNA" o RNAa. È stato dimostrato che i dsRNAs che hanno come target dei promotori genici inducono una potente attivazione trascrizionale dei geni associati. RNAa sono stati scoperti in cellule umane usando dsRNAs sintetici, chiamati "piccoli RNA attivanti" (saRNAs). Attualmente non è noto se RNAa è conservato in altri organismi.<ref>{{Cita libro|autore=Li LC|titolo=Small RNA-Mediated Gene Activation. RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity|url=https://archive.org/details/rnaregulationofg0000unse|anno=2008|editore=Caister Academic Press|città=|p=|pp=|ISBN=978-1-904455-25-7}}</ref>

==Specificità degli siRNA==

La RNAi si interseca con diversi altri processi cellulari. Non è dunque sorprendente che l'introduzione di siRNA nella cellula possa indurre alcuni effetti non specifici. Una cellula di [[mammifero]], ad esempio, può ''interpretare'' una molecola di RNAds come un composto di origine [[virus|viralevira]]le, avviando una risposta [[sistema immunitario|immunitaria]]<ref>{{en}} [http://www.biochemsoctrans.org/bst/032/0952/bst0320952.htm Sledz CA ''et al'' RNA interference and double-stranded-RNA-activated pathways. Biochem. Soc. Trans.. (2004) 32, (952–956)]</ref>. Inoltre, dal momento che i [[miRNA|microRNA]] (molecole prodotte dalla cellula per regolare l'[[espressione genica]]) sono estremamente simili come struttura ai siRNA, sono possibili indesiderate interferenze anche con questoquesta ''pathway''.

===Immunità innata===

L'introduzione di troppo siRNA può generare diverse risposte cellulari aspecifiche in grado di attivare una risposta immunitaria innata. La maggior parte dei lavori scientifici sembra indicare che ciò sia dovuto alla presenza di PKR<ref>{{en}} [http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/112161228/ABSTRACT?CRETRY=1&SRETRY=0 Zhang Z ''et al'' siRNA binding proteins of microglial cells: PKR is an unanticipated ligand. J Cell Biochem. 2006 Apr 15;97(6):1217-29]</ref>, un ''sensore'' cellulare per gli RNAds, e sembra probabile il coinvolgimento anche del gene RIG-I (acronimo di ''retinoic acid inducible Gene I''). Un metodo promettente per ridurre l'effetto aspecifico consiste nell'adattare gli siRNA fino a far assumer loro la struttura di un microRNA. Dal momento che la presenza citosolica dei microRNA è assolutamente ''naturale'' e comporta uno dei più potenti meccanismi di silenziamento cellulare, tale approccio promette di essere molto efficace, permettendo di incorporare minori concentrazioni di siRNA per avere un silenziamento molto più efficiente e selettivo.

===Bersagli errati===

Si è riscontrato che alcuni mRNA non perfettamente complementari con la molecola di siRNA somministrata possono comunque andare incontro a degradazione<ref>{{en}} [https://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n3/abs/nmeth854.html Birmingham A ''et al'' 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets Nature Methods 3, 199 - 204 (2006)]</ref>. Questo comporta ulteriore aspecificità di azione degli siRNA. Questo problema, in ogni caso, può essere superato attraverso un oculato ''design'' dei siRNA. La costruzione di siRNA ''ottimizzati'' per ottenere la massima specificità viene comunemente svolta con il supporto di [[algoritmo|algoritmi]] in grado di selezionarne la composizione migliore. I numerosi studi in corso sull'[[espressione genica]] e sulle caratteristiche del [[-omics|trascrittoma]] stanno attualmente permettendo di raffinare tali algoritmi.

==Prospettive future==

La possibilità di silenziare in teoria qualsiasi gene attraverso la RNAi indotta da siRNAs sta suscitando un grande interesse nella comunità scientifica così come dell'industria farmaceutica e biotecnologica.

<!--(Opinion 1)

Given the ability to knockdown essentially any gene of interest, RNAi via siRNAs has generated a great deal of interest in both basic and applied biology. There is an increasing number of large-scale RNAi screens that are designed to identify the important genes in various biological pathways. As disease processes also depend on the activity of multiple genes, it is expected that by turning off their activity with siRNAs or their biosynthetic precursors, therapeutic benefit can be derived directly via RNAi. Indeed, phase I results of the first two therapeutic RNAi trials (indicated for age-related macular degeneration, aka AMD) reported at the end of 2005, demonstrate that siRNAs are well tolerated and have suitable pharmacokinetic properties. SiRNAs and related RNAi induction methods therefore stand to become an important new class of drugs in the foreseeable future.

===siRNA nella ricerca di base===

(Opinion 2)

L'utilizzo di siRNA e relativi shRNA per silenziare specifici geni sta diventando un utile strumento di ''silenziamento genico'' per la ricerca di base. Rimangono tuttavia diversi problemi ancora da superare. Una delle maggiori sfide per terapie basate siRNA e RNAi è la “consegna” intracellulare.<ref name=":0">{{Cita pubblicazione|autore=Petrocca, Fabio and Lieberman|titolo=Promise and Challenge of RNA Interference-Based Therapy for Cancer|rivista=Journal of Oncology. Biology of Neoplasia|volume=29|numero=6}}</ref> La “consegna” di siRNA tramite nanoparticelle ha mostrato risultati promettenti.<ref name=":0" /><ref name=":1">{{Cita pubblicazione|nome=H|cognome=Shen|titolo=Nanovector delivery of siRNA for cancer therapy|rivista=Cancer Gene Therapy|volume=19|numero=6|pp=367-373|doi=10.1038/cgt.2012.22|url=https://www.nature.com/doifinder/10.1038/cgt.2012.22|nome2=T|cognome2=Sun|nome3=M|cognome3=Ferrari}}</ref> Gli oligo siRNA in vivo sono vulnerabili alla degradazione da parte delle nucleasi plasmatiche e tissutali<ref name=":1" /> e hanno mostrato solo una lieve efficacia in target localizzati, come l'occhio umano.<ref name=":2">{{Cita pubblicazione|nome=John C.|cognome=Burnett|data=2012-01-27|titolo=RNA-Based Therapeutics: Current Progress and Future Prospects|rivista=Chemistry & Biology|volume=19|numero=1|pp=60-71|accesso=2016-07-11|doi=10.1016/j.chembiol.2011.12.008|nome2=John J.|cognome2=Rossi}}</ref> Utilizzare DNA puro è impegnativo, a causa della loro grande dimensione e perché la struttura impedisce loro di diffondere facilmente attraverso le membrane.<ref name=":0" /> Gli oligo siRNA sembrano aggirare questo problema grazie alle loro piccole dimensioni, 21-23 oligo. Permettendo il loro arrivo a destinazione tramite dei vettori, chiamati nanovettori.<ref name=":2" /> Un buon nanovettore per il targeting tramite siRNA dovrebbe proteggere il siRNA dalla degradazione, aumentando la presenza dei siRNA nell'organo bersaglio e facilitandone l'assorbimento cellulare. I tre gruppi principali di nanovettori per siRNA sono: a base lipidica o non lipidica, a base organica e inorganica. I nanovettori a base lipidica sono eccellenti per il targeting tramite siRNA per i tumori solidi, ma altri tipi di tumore possono richiedere diversi nanovettori organici a base non lipidica, come nanoparticelle a base di ciclodestrine.<ref name=":1" /> I siRNA distribuiti mediante nanoparticelle a base lipidica hanno un potenziale terapeutico per i disturbi del sistema nervoso centrale (SNC), ma la barriera emato-encefalica (BBB), spesso blocca l'accesso a potenziali agenti terapeutici per il cervello. I siRNA distribuiti mediante nanoparticelle a base di lipidi sono in grado di attraversare completamente la BBB<ref>{{Cita pubblicazione|autore=Gomes, Dreier, Brewer et. al.|titolo=A new approach for a blood-brain barrier model based on phospholipid vesicles: Membrane development and siRNA-loaded nanoparticles permability.|rivista=Journal of Membrane Science|volume=503. p.8-15. Published: March 2016.|numero=}}</ref>. Un altro problema nella consegna dei siRNA è la questione dell'off-targeting. Dal momento che i geni vengono letti in entrambe le direzioni, esiste la possibilità che oltre a interferire con l'mRNA bersaglio, il siRNA dell'altro filamento possa interferire con un'altra proteina coinvolta in un'altra funzione. Inoltre, i siRNA mostrano una differente efficacia in differenti tipi cellulari, apparentemente indiscriminatamente (non è infatti possibile definire precisamente se un tipo cellulare sia responsivo ai siRNA oppure no). Rimane in ogni caso il problema delle risposte cellulari aspecifiche, ancora poco comprese. Finché queste due questioni non saranno comprese a fondo e risolte, non sarà possibile la produzione di ''farmaci ad acidi nucleici pienamente affidabili''.

Using siRNA's/shRNA's to knockdown specific genes is certainly a valuable tool in the laboratory. However, there are a great deal of challenges when it comes to taking a laboratory technique and applying it to living animals, especially humans. Firstly, siRNA's show different effectiveness in different cell types, apparently indiscriminately - some cells respond well to siRNA's and show a robust knockdown, others show no such knockdown (even despite efficient [[transfection]]). Secondly, and most importantly, the non-specific responses of si/shRNA's are still relatively poorly understood. Until these responses can be understood and overcome, the chances of using si/shRNA's outside of the lab, e.g. as an effective new class of drug, remain slim. (As such, [[Ian McEwan]]'s novel "[[Saturday (novel)|Saturday]]" suggests false promise in the hope of an siRNA-based treatment for [[Huntington's Disease]]).

===siRNA nella ricerca farmaceutica===

==Voci correlate==

Viste le potenzialità dell'intervento farmacologico sui mRNA, hanno avuto inizio numerosi ''screening'' sul trascrittoma, così come numerosi test di funzionalità di numerosi siRNA. Dal momento che i processi [[patologia|patologici]] dipendono solitamente dall'espressione sregolata di diversi geni, infatti, ci si attende che la somministrazione di siRNA sia in grado di ''spegnere'' tale espressione (attraverso la RNAi); ciò potrebbe comportare un sensibile miglioramento delle terapie ''[[palliativo|palliative]]'' attualmente utilizzate. La ''fase I'' dei ''trial clinici'' di due ''farmaci a RNA'' (in particolare per il trattamento per la [[degenerazione maculare]]) sta in effetti dimostrando che i siRNA sono ben tollerati e mostrano una buona efficacia. In un altro studio clinico di fase 1, a 41 pazienti con cancro avanzato metastatizzato al fegato sono stati somministrati RNAi coniugati con le nanoparticelle lipidiche. Gli RNAi hanno come target due geni che codificano per proteine chiave nella crescita delle cellule tumorali, il fattore di crescita del endotelio vascolare (VEGF), e la proteina KSP (kinesin spindel protein). I risultati hanno mostrato un beneficio clinico, con la stabilizzazione del cancro dopo sei mesi o regressione delle metastasi in alcuni dei pazienti. L'analisi farmacodinamica di campioni bioptici dei pazienti ha rivelato la presenza degli RNAi nei campioni, dimostrando che le molecole raggiungono il bersaglio designato.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Josep|cognome=Tabernero|data=2013-04-01|titolo=First-in-humans trial of an RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement|rivista=Cancer Discovery|volume=3|numero=4|pp=406-417|accesso=2016-07-11|doi=10.1158/2159-8290.CD-12-0429|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23358650|nome2=Geoffrey I.|cognome2=Shapiro|nome3=Patricia M.|cognome3=LoRusso}}</ref> Alcune prove hanno indicato che i siRNA Ebola-mirati possono essere efficaci come profilassi post-esposizione negli esseri umani, con il 100% di primati sopravvissuti a una dose letale di [[Zaire ebolavirus|Zaire Ebolavirus]], il ceppo più letale.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Thomas W.|cognome=Geisbert|data=2010-05-29|titolo=Postexposure protection of non-human primates against a lethal Ebola virus challenge with RNA interference: a proof-of-concept study|rivista=Lancet (London, England)|volume=375|numero=9729|pp=1896-1905|accesso=2016-07-11|doi=10.1016/S0140-6736(10)60357-1|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20511019|nome2=Amy C. H.|cognome2=Lee|nome3=Marjorie|cognome3=Robbins}}</ref> Quindi i siRNA e la relativa induzione di RNAi, dunque, promettono di dar vita ad una nuova importante classe di farmaci.

[[miRNA|MicroRNA (miRNA)]] are small ribonucleaic acid chains, ~22nt long. They have been implicated in cell growth and apoptosis, embrionic development, neuronal plasticity and remodeling, and even insulin secretion. An overabundance of miRNA has been reported in cases of Fragile X Mental Retardation while some cancers have been reported to have downregulated miRNA genes.

== Note ==

Initial studies indicate that miRNAs regulate development and gene expression locally and post-transcriptionally, at the level of translation. In plants the miRNA is highly complimentary to the gene of interest and may target the 5' regulatory region, the 3' UTR, introns, exons, or almost loci within the gene. Base-pairing in plants prompts an RNA induced silencing complex (RISC) response. In animals, the miRNA anneals to the 3' UTR region and represses translation of the gene through a yet unexplained mechanism.

<references/>

== Voci correlate ==

The miRNAs start out as an RNA precursor, an oligonucleotide approximately 75nt long and in a "hairpin" structure. The "hairpin" is processed by Dicer and cut into the smaller , ~22nt long, miRNA. Multiple miRNAs can be found on the same precursor.

*[[RNA interference]]

*[[miRNA]]

*[[shRNA]]

*[[Silenziamento genico]]

== Altri progetti ==

Check out an illustrated tutorial on miRNA.[http://www.ambion.com/main/explorations/mirna.html]

{{interprogetto}}

-->

==Bibliografia==

<references/>

<!--

<!--General background:

*[http://www.nature.com/nature/journal/v431/n7006/full/nature02870.html Unlocking the potential of the human genome with RNA interference - a good introductory review article]

*[http://www.nature.com/nature/journal/v391/n6669/abs/391806a0_fs.html Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in ''Caenorhabditis elegans'' - the original paper by Fire et. al. describing RNAi]

*[http://www.genesdev.org/cgi/content/full/15/2/188 RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs]

*[http://www.cell.com/content/article/abstract?uid=PIIS0092867400806200 RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals]

== Collegamenti esterni ==

Non-specific effects:

* {{Collegamenti esterni}}

*[http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/112161228/ABSTRACT?CRETRY=1&SRETRY=0 siRNA binding proteins of microglial cells: PKR is an unanticipated ligand]

*[http://www.nature.com/nbt/journal/v23/n2/abs/nbt1051.html Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy]

*[http://www.biochemsoctrans.org/bst/032/0952/bst0320952.htm RNA interference and double-stranded-RNA-activated pathways]

*[http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1432-0436.2004.07202001.x Determinants of interferon-stimulated gene induction by RNAi vectors]

*[http://www.nature.com/ncb/journal/v5/n9/abs/ncb1038.html Activation of the interferon system by short-interfering RNAs]

*[http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n3/abs/nmeth854.html 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets]-->

==Collegamenti esterni==

* {{en}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=10542148&query_hl=3 Prima descrizione degli siRNA (1999)]

* {{en}} [http://design.rnai.jp/ ''siDirect'': un software ''on-line'' per individuare sequenze di siRNA]

* {{en}} [http://nar.oupjournals.org/cgi/content/full/32/suppl_2/W124 Articolo di presentazione di ''siDirect'']

* {{en}} [http://nar.oupjournals.org/cgi/content/full/32/3/936 Articolo sulla efficacia di ''siDirect'']

* {{en}} [http://www.human-siRNA-database.net ''HuSiDa'': Human siRNA Database]

* {{en}} [http://siRNA.cgb.ki.se ''siRNAdb'': un database delle sequenze di siRNA]

* {{en}} [http://sisearch.cgb.ki.se ''siSearch'': uno strumento per il ''design'' delle sequenze di siRNA]

* {{en}} [http://sonnhammer.cgb.ki.se/SpecificityServer/ ''SpecificityServer'': uno strumento per testare la specificità di un determinato siRNA]

* {{en}} [http://miracle.igib.res.in/miracle/ ''miRacle'': strumento per la predizione di bersagli molecolari per siRNA e microRNA attraverso un algoritmo che analizza le strutture secondarie dell'RNA]

{{Acidi nucleici}}

{{Biologia molecolare}}

{{Genetica}}

{{Portale|Biologia}}

[[Categoria:RNA]]

[[ca:SiRNA]]

[[de:Kleine RNA]]

[[en:small interfering RNA]]

[[es:ARN interferente pequeño]]

[[fr:ARN interférent]]

[[lt:SiRNR]]

[[nl:SiRNA]]