CRISPR: differenze tra le versioni
Contenuto cancellato Contenuto aggiunto
Nessun oggetto della modifica Etichette: Annullato Modifica da mobile Modifica da web per mobile |
|||
| (30 versioni intermedie di 25 utenti non mostrate) | |||
Riga 1:
[[File:4qyz.jpg|miniatura]]
'''CRISPR''' (pronuncia italiana: {{IPA|/ˈkrisper/|it}}; pronuncia [[lingua inglese|inglese]]: {{IPA|[ˈkɹɪspəɹ]|en}})<ref>l'acronimo viene pronunciato "''crisper''" ({{cita web|url=https://www.nature.com/scitable/blog/bio2.0/editing_genomes_with_the_bacterial||titolo=Editing Genomes with the Bacterial Immune System|cognome=Sawyer|nome=Eric|sito=Scitable|editore=Nature Publishing Group|accesso=6 aprile 2015|giorno=9|mese=febbraio|anno=2013|tipo=blog}}); al plurale, nella letteratura scientifica in lingua inglese, viene scritto ''CRISPRs''</ref>
Queste brevi ripetizioni sono sfruttate dal batterio per riconoscere e distruggere il [[genoma]] proveniente da virus simili a quelli che hanno originato le CRISPR: costituiscono dunque una forma di [[Immunità adattativa|immunità acquisita]] dei procarioti.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Rodolphe|cognome=Barrangou|data=
▲Queste brevi ripetizioni sono sfruttate dal batterio per riconoscere e distruggere il [[genoma]] proveniente da virus simili a quelli che hanno originato le CRISPR: costituiscono dunque una forma di [[Immunità adattativa|immunità acquisita]] dei procarioti.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Rodolphe|cognome=Barrangou|data=February 2015|titolo=The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond|rivista=Current Opinion in Immunology|volume=32|pp=36–41|accesso=2 ottobre 2017|doi=10.1016/j.coi.2014.12.008|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25574773}}</ref>
Le CRISPR costituiscono uno degli elementi di base del sistema CRISPR/Cas, anch'esso coinvolto nell'immunità acquisita dei procarioti. Una versione semplificata di questo sistema (detta CRISPR/[[Cas9]]) è stata modificata per fornire un potentissimo e precisissimo strumento di [[Editing genomico|modificazione genetica]] che risulta di impiego molto più facile, e al contempo più economico, rispetto alle tecnologie preesistenti. Grazie al sistema CRISPR/Cas9 è stato possibile modificare permanentemente i geni di molteplici organismi.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Feng|cognome=Zhang|data=15 settembre 2014|titolo=CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges|rivista=Human Molecular Genetics|volume=23|numero=R1|pp=R40–46|accesso=2 ottobre 2017|doi=10.1093/hmg/ddu125|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24651067|nome2=Yan|cognome2=Wen|nome3=Xiong|cognome3=Guo}}</ref>
Riga 12 ⟶ 10:
[[File:VNTR2individuals5or7repeats.png|miniatura|Un esempio di ripetizioni di sequenze di DNA organizzate "in tandem". Si noti l'assenza di "DNA Spaziatore".]]
===
La prima descrizione di quello che sarebbe stato chiamato nel futuro CRISPR avvenne nel 1987 all'[[università di Osaka]] (Giappone). Infatti il ricercatore [[Yoshizumi Ishino]] clonò [[Serendipità|accidentalmente]] una porzione di CRISPR insieme al gene iap (inhibitor of apoptosis), il vero bersaglio dei suoi esperimenti. La porzione di CRISPR venne descritta come una ripetizione di sequenze di DNA "atipica" a causa dell'interposizione di [[DNA non codificante|DNA "spaziatore"]] tra una sequenza e l'altra.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Y|cognome=Ishino|data=
Le ripetizioni di DNA tipiche sono difatti organizzate "in tandem", ovvero localizzate in maniera contigua senza l'interposizione di nessun DNA spaziatore tra una sequenza e l'altra.
Non si conosceva in quel periodo il significato di ripetizioni presenti ad intervalli irregolari.<ref name="ncbi.nlm.nih.gov">{{Cita pubblicazione|nome=Patrick D.|cognome=Hsu|data=5 giugno 2014|titolo=Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering|rivista=Cell|volume=157|numero=6|pp=
===
Nel 1993 un gruppo di ricercatori dei Paesi Bassi pubblicò due articoli riguardanti il [[genoma]] di ''[[Mycobacterium tuberculosis]]'', in particolar modo soffermandosi sulla presenza di un cluster (un insieme) di ripetizioni dirette (DR, Direct Repeats) interrotte da DNA Spaziatore.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=D|cognome=van Soolingen|data=
===
Sempre nel 1993 il microbiologo [[Francisco Mojica]] dell'[[università di Alicante]] (Spagna) scoprì insieme ai suoi collaboratori la presenza di cluster di ripetizioni di DNA nelle specie di [[Archaea|archei]] Haloferax e Haloarcula. Mojica tentò di dare un ruolo a questi cluster: dal momento che in Haloferax Vulcanii non potevano coesistere [[Plasmide|plasmidi]] e [[Cromosoma|cromosomi]] con cluster di ripetizione uguali, egli ipotizzò un ruolo di questi nel permettere una corretta segregazione del DNA replicato nelle cellule figlie durante la divisione cellulare. Questa ipotesi si rivelò errata, anche se Mojica scoprì per la prima volta la trascrizione di sequenze ripetute interrotte.<ref name="Francisco J. M 2016"/><ref name="ReferenceA">{{Cita pubblicazione|nome=Francisco J. M.|cognome=Mojica|data=
Nel 2001 Mojica e Ruud Jansen, che stava ricercando altre ripetizioni interrotte, proposero l'acronimo CRISPR come acronimo "universale" per identificare tutte queste sequenze descritte da acronimi diversi nella storia della letteratura scientifica.<ref name="ReferenceA"/><ref>{{Cita libro|titolo=Barrangou R, van der Oost J (2013). CRISPR-Cas Systems : RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea. Heidelberg: Springer. p. 6. ISBN 978-3-642-34656-9.}}</ref>
===
[[File:201412 CRISPRCAS9blue.png|miniatura|Schema grafico dell'enzima Cas9, in grado di assolvere a due funzioni fondamentali: # riconoscimento della struttura "estranea" da tagliare/clivare (di solito il genoma del patogeno che sta infettando il batterio); # taglio della struttura. Modificando Cas9 è possibile "vaccinare" il batterio contro l'infezione di batteriofagi.
]]
Un passo in avanti verso una migliore comprensione della funzione dei CRISPR avvenne grazie al contributo di Ruud Jansen dell'[[Università di Utrecht]] e collaboratori: egli osservò che nei [[Prokaryota|procarioti]] l'insieme (cluster) di ripetizioni era accompagnato da un set di geni omologhi che aiutavano a costituire i "sistemi associati a CRISPR" (''CRISPR associated system'', in sigla geni ''cas'').
All'inizio furono scoperti quattro geni cas (cas 1-4); solo in seguito fu caratterizzata la natura dei trascritti di questi geni: le proteine contenevano domini elicasici e nucleasici<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Ruud|cognome=Jansen|data=
===
Nel 2005 tre gruppi di ricerca tra loro indipendenti dimostrarono che alcuni spaziatori presenti nei CRISPR derivavano da DNA di batteriofagi o da DNA extra-cromosomico (es. DNA di plasmidi)<ref>{{Cita pubblicazione|nome=C.|cognome=Pourcel|data=
La prima ricerca che ipotizzò un ruolo di CRISPR-Cas nell'immunità adattativa venne pubblicata dal gruppo di Mojica<ref name="ReferenceC"/>. Egli ipotizzò la presenza di un sistema analogo a quello
# Acquisizione di una sequenza spacer, dovuta a una precedente "invasione" del virus, nel locus CRISPR del genoma batterico;
# Trascrizione del DNA-spacer in RNA;
# Utilizzo dell'[[RNA-spacer]] per riconoscere la nuova invasione da parte dello stesso virus.
Questa nuova ipotesi si rivelò essere corretta, eccetto un dettaglio: nella RNAi viene degradato RNA estraneo, il sistema CRISPR-Cas invece degrada DNA.
Parallelamente a ciò vennero proposte altre due ipotesi da altri ricercatori che tentavano di spiegare la funzione di CRISPR nei procarioti:
* Koonin e colleghi estesero l'ipotesi di Mojica (sistema analogo al Rna-interference degli eucarioti) ai geni CAS ed elencarono i diversi meccanismi di azione dei diversi sottotipi dei sistemi Cas-CRISPR;<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Kira S.|cognome=Makarova|data=16 marzo 2006|titolo=A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action|rivista=Biology Direct|volume=1|p=7|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1186/1745-6150-1-7|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16545108|nome2=Nick V.|cognome2=Grishin|nome3=Svetlana A.|cognome3=Shabalina}}</ref>
* Altri ricercatori ipotizzarono che le sequenze CRISPR indirizzavano in qualche modo gli enzimi CAS a degradare il DNA Virale.<ref name="A" /><ref name="Patrick D 2014">{{Cita pubblicazione|nome=Patrick D.|cognome=Hsu|data=5 giugno 2014|titolo=Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering|rivista=Cell|volume=157|numero=6|pp=
===
Numerose ricerche condotte
# Una regione CRISPR di [[Streptococcus thermophilus]] acquisì delle sequenze di DNA-spacer per mezzo dell'invasione di un [[batteriofago]];
# Si aggiungevano e rimuovevano DNA-spacer dalla sequenza conosciuta e uguale a quella acquisita dal batterio per mezzo del [[batteriofago]];
# Si osservava che [[Streptococcus thermophilus]] diventava "resistente" al batteriofago se si aggiungeva un DNA-spacer simile a quello del [[batteriofago]].<ref name="B">{{Cita pubblicazione|nome=Luciano A.|cognome=Marraffini|data=1º ottobre 2015|titolo=CRISPR-Cas immunity in prokaryotes|rivista=Nature|volume=526|numero=7571|pp=
Nel 2008, Brouns e colleghi identificarono in [[Escherichia coli|E.
# frammenti di RNA che contenevano soltanto le sequenze ripetute;
# frammenti di RNA che contenevano soltanto le sequenze spacer, che rimanevano ancorati al complesso proteico Cas.
Sempre nel 2008 Marraffini e Sontheimer dimostrarono che una sequenza CRISPR di ''S. epidermidis'', per prevenire l'invasione di un batteriofago ([[Coniugazione batterica|coniugazione]]), agiva contrastando il suo DNA e non il suo RNA. Questa ipotesi si discostava da quella dell'RNAinterference di Mojica, che allo stesso momento veniva confermata dal sistema CRISPR-Cas di [[Pyrococcus furiosus]] che preveniva l'infezione riconoscendo l'RNA del non-self.<ref name="Patrick D 2014"/><ref name="B" />
Nel 2010 uno studio ha dimostrato che in ''S. thermophilus'' il sistema CRISPR-Cas tagliava entrambi i filamenti del fago e del DNA del plasmide.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Josiane E.|cognome=Garneau|data=4 novembre 2010|titolo=The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA|rivista=Nature|volume=468|numero=7320|pp=
===
I ricercatori hanno scoperto nel batterio Streptococcus pyogenes un sistema CRISPR molto semplice che utilizza la proteina Cas9.
Cas9 è un'[[endonucleasi]] a quattro componenti che si associa con delle piccole molecole di RNA per formare un complesso ribonucleoproteico:
# Un [[crRNA]] (CRISPR-RNA):
# Un [[trascrRNA]] (trans-activating CRISPR RNA).<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Rodolphe|cognome=Barrangou|data=9 novembre 2015|titolo=Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines|rivista=Genome Biology|volume=16|
[[Jennifer Doudna]] e [[Emmanuelle Charpentier]] hanno ri-ingegnerizzato l'endonucleasi Cas9 in un sistema a due componenti molto più maneggevole fondendo le due molecole di RNA in un unico RNA denominato "[[single-guide RNA]]" che, quando fuso a Cas9, può cercare e tagliare il DNA-target specificato da questo. Manipolando la sequenza del single-guide RNA, il sistema artificiale Cas9 può essere ingegnerizzato in maniera tale da riconoscere e tagliare qualsiasi sequenza di DNA.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Martin|cognome=Jinek|data=17 agosto 2012|titolo=A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity|rivista=Science (New York, N.Y.)|volume=337|numero=6096|pp=
Per questo lavoro Doudna e Charpentier sono state insignite del [[Premio Nobel per la chimica]] 2020 "per lo sviluppo di un metodo per l'editing del genoma".
[[File:Cas9 5AXW.png|miniatura|700x700px]]▼
Un altro gruppo di ricercatori (composto da Šikšnysin, Gašiūnas, Barrangou e Horvath) ha dimostrato che Cas9 del sistema CRISPR di ''S. thermophilus'' può essere riprogrammata maneggiando la sequenza del suo crRNA per riconoscere la sequenza di DNA di gradimento del ricercatore. Questa scoperta ha aumentato la versatilità del sistema CRISPR-Cas nell'editing dei genomi di diversi organismi.
Altri due gruppi di ricercatori (di Feng Zhang e George Church) hanno simultaneamente descritto la possibilità di modificare il genoma di cellule umane (in coltura, [[in vitro]]) utilizzando il sistema CRISPR/Cas9.<ref name="ncbi.nlm.nih.gov"/><ref>{{Cita pubblicazione|nome=Francisco J. M.|cognome=Mojica|data=
Altre ricerche hanno dimostrato la possibilità del sistema CRISPR/Cas9 di modificare il genoma dei seguenti organismi modello:
*
*
*
*
*
* [[Mus musculus|
* [[Simiiformes|
*
Infine è stata dimostrata la possibilità di modificare CRISPR per generare fattori di trascrizioni "programmabili" che siano in grado di riconoscere e attivare/silenziare geni specifici.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Matthew H.|cognome=Larson|data=
===
Nel 2015 è stata scoperta Cpf1, una nucleasi appartenente al sistema CRISPR/Cpf1 nel batterio ''Francisella novicida''.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Bernd|cognome=Zetsche|data=22 ottobre 2015|titolo=Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas system|rivista=Cell|volume=163|numero=3|pp=
* la modalità di "taglio" del DNA riconosciuto: Cpf1 genera dei tagli "sfalsati" con delle "sticky-ends", a differenza di Cas9 che genera dei tagli netti;
* l'utilizzo di una sequenza PAM, descritta più avanti, "T-rich" (ricca di timina) che permette a Cpf1 di riconoscere parti alternative di DNA rispetto a Cas9;
* l'utilizzo del solo CRISPR-RNA (crRNA) per una corretta individuazione della sequenza di DNA da tagliare. Cas9 necessita sia di crRNA che trascrRNA.
===
A ottobre 2017 un gruppo di scienziati guidati da David Liu di Harvard usa CRISPR per individuare determinati geni nel DNA che servirà poi agli Adenine Base editor (modificatori della base Adenina) per sostituire in maniera puntuale una base azotata<ref>{{cita news| url = http://www.repubblica.it/salute/2017/10/25/news/ingegneria_genetica_arriva_la_matita_rossa_per_correggere_il_dna-179324119/ |titolo = Ingegneria genetica, arriva la "matita rossa" per correggere il Dna|pubblicazione = repubblica.it|data = 25 ottobre 2017|accesso = 16 novembre 2017}}</ref>.
===
A novembre [[2017]] un articolo di [[Nature Biotechnology]] scritta da un gruppo del [[Massachusetts Institute of Technology|MIT]] descrive l'utilizzo con successo di nanoparticelle lipidiche anziché virus come vettore di CRISPR per agire sul gene [[Pcsk9]] che regola i livelli di colesterolo nel [[fegato]]<ref>{{cita news|titolo = |pubblicazione = lescienze.it| data = 15 novembre 2017
===
A fine gennaio [[2018]] un'équipe dell'[[Università degli Studi di Trento]] presenta un'ulteriore evoluzione della CRISPR-Cas9 dove Cas9 è stata fatta sviluppare in vitro con dei lieviti. Gli esperimenti sono stati condotti con tecnica di sequenziamento ''genome wide''. Per l'innovazione è già stato richiesto il brevetto<ref name="EvoCas9">{{cita news|url = http://www.repubblica.it/scienze/2018/01/30/news/evolve_crispr_cas9_la_tecnica_che_modifica_il_dna-187630265/?ref=RHPPLF-BH-I0-C8-P7-S1.8-T1 | titolo = Scoperta un'arma di precisione contro il Dna malato |pubblicazione = repubblica.it| data = 31 gennaio 2018 |accesso = 31 gennaio 2018}}</ref><ref name="EvoCas9-2" >{{cita news|url = http://www.lescienze.it/news/2018/01/30/news/crispr_record_forbici_molecolari_italia_meldolesi-3839694/ | titolo = CRISPR: un record italiano per le super forbici molecolari |pubblicazione = lescienze.it| data = 31 gennaio 2018 |accesso = 31 gennaio 2018}}</ref>.
Ulteriori evoluzioni potrebbero prevedere l'uso di altri enzimi per correggere le lettere DNA senza la necessità di tagliare oppure si potrebbe dare il via a una progettazione ad hoc di numerose "Cas9" per ogni gene che si andrà a modificare<ref name="EvoCas9"/><ref name="EvoCas9-2"/>.
Riga 105:
# Delle nucleasi con dominio a dita di zinco delle proteine sintetiche con domini leganti il DNA con attività nucleasica, in grado di clivare il DNA in punti specifici;
# Le TALENS (nel 2010), ovvero delle nucleasi transcription activator-like effector sintetiche; esse erano in grado di clivare meglio e più facilmente dei locus di DNA predefiniti;
Sia le nucleasi con dominio a dita di zinco sia le TALENS richiedono la creazione di una proteina personalizzata per ogni sequenza di DNA da tagliare: questo requisito rende entrambe le tecniche più dispendiose in termini di tempo e risorse economiche rispetto alla creazione degli "RNA a guida singola" utilizzati nel sistema CRISPR-CAS9. In altre parole i sistemi CRISPR/Cas sono più facili da progettare poiché è richiesta la generazione di una molecola di RNA e non di una proteina.<ref>{{Cita news|lingua=en|nome=Susan Young|cognome=Rojahn|url=https://www.technologyreview.com/review/524451/genome-surgery|titolo=DNA Editing Tools Are Opening the Door to Custom-Made Genomes|pubblicazione=MIT Technology Review|accesso=3 ottobre 2017|urlmorto=sì|urlarchivio=https://web.archive.org/web/20160112051853/http://www.technologyreview.com/review/524451/genome-surgery/}}</ref>
== Struttura del locus CRISPR ==
[[File:SimpleCRISPR.jpg|miniatura|Diagramma semplificato di un locus CRISPR. Sono mostrati i tre componenti principali del locus: 1. I geni "cas"; 2. La sequenza leader; 3. Un modulo formato da DNA ripetuto (riquadri grigi) e spaziatori tra esso interposti (linee colorate). L'ordine delle tre componenti non è sempre uguale a quello mostrato nella figura.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Philippe|cognome=Horvath|data=8 gennaio 2010|titolo=CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea|rivista=Science (New York, N.Y.)|volume=327|numero=5962|pp=
Una CRISPR è costituita da una sequenza leader seguita da brevi ripetizioni di DNA che sono separate tra loro mediante degli spaziatori o spacers, altre sequenze di DNA dalla sequenza unica e non ripetuta.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Frank|cognome=Hille|data=5 novembre 2016|titolo=CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance|rivista=Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences|volume=371|numero=1707|accesso=2 ottobre 2017|doi=10.1098/rstb.2015.0496|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5052741/|nome2=Emmanuelle|cognome2=Charpentier}}</ref> Al locus CRISPR possono essere associati i geni cas descritti in seguito.
Riga 115:
=== Componente 2: Ripetizioni ===
Le ripetizioni in un locus CRISPR hanno una grandezza variabile: solitamente oscillano dai 28 ai 37 bp (''[[Coppia di basi|base-pairs]]''), anche se sono state scoperte delle ripetizioni molto più corte (23 bp) e molto più lunghe (
Alcune delle ripetizioni sono palindrome; ne consegue che quando sono trascritte formano un RNA che assume una struttura secondaria "a forcina".
Riga 122:
=== Componente 3: Spaziatore (DNA-Spacer) ===
La grandezza degli spacer nei diversi moduli CRISPR oscilla dai 21 ai 72
Gli spacer derivano dal "patogeno" che ha tentato in passato di infettare il batterio. Nuovi spacer pertanto possono apparire in maniera molto rapida per favorire la risposta immunitaria adattativa in seguito all'infezione del patogeno, per esempio batteriofago.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Gene W.|cognome=Tyson|data=
Il numero degli spacer per ogni array-CRISPR è solitamente minore di 50 unità.<ref name="C" />
Riga 131:
In vicinanza delle ripetizioni e degli spaziatori nel locus CRISPR possono essere presenti dei clusters di geni cas.
In totale sono stati scoperti 93 geni cas; essi sono accorpati in 35 famiglie in base alla somiglianza di sequenza delle proteine da essi
== Eterogeneità dei sistemi CRISPR/Cas ==
Riga 154:
|-
| 1 || I || Cas3 || Nucleasi con dominio HD e specificità per DNA a singolo filamento; possiede inoltre un dominio ad attività elicasica ATP-dipendente.
|<ref name="pmid21343909">{{Cita pubblicazione|coautori= Sinkunas T, Gasiunas G, Fremaux C, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V |titolo= Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system |rivista= The EMBO Journal |volume= 30 |numero= 7 |pp=
|-
| || IA || Cas8a, Cas5 || rowspan="3" | Subunità del modulo di interferenza: importante per identificare il DNA "estraneo" grazie al riconoscimento della sequenza PAM. || rowspan="3" |<ref name=Makarova2015>{{Cita pubblicazione|coautori= Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Haft DH, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Terns RM, Terns MP, White MF, Yakunin AF, Garrett RA, van der Oost J, Backofen R, Koonin EV |titolo= An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems |rivista= Nature Reviews. Microbiology |volume= 13 |numero= 11 |pp=
|-
| || IB || Cas8b
Riga 162:
| || IC || Cas8c
|-
| || ID || Cas10d || rowspan="2" | Contiene un dominio omologo al dominio a "forma di palmo" delle polimerasi degli acidi nucleici e delle ciclasi dei nucleotidi. || rowspan="2" |<ref name="pmid24728998">{{Cita pubblicazione|coautori= Chylinski K, Makarova KS, Charpentier E, Koonin EV |titolo= Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems |rivista= Nucleic Acids Research |volume= 42 |numero= 10 |pp=
|-
| || IE || Cse1, Cse2
Riga 186:
| || IVB || || ||
|-
| 2 || II || [[Cas9]] || [[Nucleasi]] RuvC eHNH che insieme producono [[double-strand breaks|DSBs]] (Double-Strand-Breaks: Rotture a doppio filamento); separatamente possono produrre SSBs (Single-Strand Breaks: Rotture a singolo filamento). Assicurano l'acquisizione di DNA-spacer funzionanti durante il processo di adattamento. ||<ref name="pmid22949671">{{Cita pubblicazione|coautori= Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V |titolo= Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria |rivista= Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America |volume= 109 |numero= 39 |pp= E2579–86 |data=
|-
| || IIA || Csn2 || Proteina legante il DNA a forma di anello, coinvolta nella primed adaptation nei sistemi CRISPR di Tipo II. ||<ref>{{Cita pubblicazione|coautori= Nam KH, Kurinov I, Ke A |titolo= Crystal structure of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated Csn2 protein revealed Ca2+-dependent double-stranded DNA binding activity |rivista= The Journal of Biological Chemistry |volume= 286 |numero= 35 |pp=
|-
| || IIB || Cas4 || Non determinata. ||
|-
| ||IIC || || Caratterizzata dall'assenza di Csn2 or Cas4 ||<ref name="pmid23563642">{{Cita pubblicazione|coautori= Chylinski K, Le Rhun A, Charpentier E |titolo= The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems |rivista= RNA Biology |volume= 10 |numero= 5 |pp=
|-
| || V || Cpf1, C2c1, C2c3 || Nucleasi RuvC. Manca di HNH. ||<ref name="Addison V 2015">{{Cita pubblicazione|nome=Addison V.|cognome=Wright|data=14 gennaio 2016|titolo=Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering|rivista=Cell|volume=164|numero=1-2|pp=
|-
| || VI || C2c2 || ||<ref name="Addison V 2015"/>
Riga 213:
* coniugazione;
* trasformazione naturale
degradando qualsiasi acido nucleico che sia in grado di entrare nella cellula.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Luciano A.|cognome=Marraffini|data=1º ottobre 2015|titolo=CRISPR-Cas immunity in prokaryotes|rivista=Nature|volume=526|numero=7571|pp=
=== 2. Selezione di sequenze di DNA del virus: la dipendenza dalle sequenze PAM e dalle proteine Cas ===
Riga 219:
==== Contributo del virus: sequenze PAMs ====
{{Vedi anche|Motivo adiacente al Protospacer}}
Sono state effettuate diverse analisi bioinformatiche per scoprire la natura e la genesi delle sequenze del virus integrate nel genoma batterico. In particolare, si è dimostrato che le regioni nel genoma del virus ad essere integrate (i futuri spacer del locus CRISPR, adesso detti proto-spacer) non erano selezionate in maniera casuale: esse erano presenti a livello di piccole sequenze di DNA (lunghe 3-5bp) denominate PAMs (Protospacer adjacent motifs).<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Alexander|cognome=Bolotin|data=
L'analisi di molteplici sistemi Cas-CRISPR ha mostrato che le PAM sono importanti per il processo di acquisizione del protospacer nel genoma del batterio (dove verrà denominato in seguito spacer). Tuttavia, le PAMs sono essenziali per i sistemi Cas di tipo I e II, ma non per quelli di tipo III.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Philippe|cognome=Horvath|data=
==== Contributo del batterio: proteine Cas ====
Riga 227:
=== 3. Processo di acquisizione dello spacer ===
Cas1 e Cas2 sono presenti in tutti e tre i sistemi CRISPR/Cas: ciò suggerisce un loro ruolo fondamentale nell'acquisizione di DNA Spacer. Quest'osservazione è stata confermata mediante esperimenti mutazionali, dove l'inattivazione di Cas1 o di Cas2 rendeva inefficiente il processo di acquisizione, senza però incidere sulla risposta immunitaria mediata da CRISPR.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Roghiyh|cognome=Aliyari|data=
Sono state scoperte molteplici proteine Cas1 insieme alle loro strutture.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Mohan|cognome=Babu|data=
=== 4. Trascrizione del locus CRISPR per attivare la risposta immunitaria adattativa: crRNA ===
Affinché la nucleasi Cas possa in futuro riconoscere il virus e degradarne gli acidi nucleici, il batterio genera un trascritto di RNA del locus CRISPR (nel quale sono presenti porzioni di DNA di un virus simile che ha attaccato precedentemente il batterio sotto forma di "spacer"). Questo trascritto è denominato CRISPR-RNA, in sigla crRNA. Il meccanismo di produzione di crRNAs differisce tra un sistema e l'altro, ma generalmente il procedimento consiste in:
# Generazione (nel batterio) di un trascritto molto lungo che include moltissimi elementi del locus CRISPR.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Luciano A.|cognome=Marraffini|data=
# Clivaggio del trascritto per generare molteplici crRNAs mediato dalle proteine Cas.
Nel crRNA risiede la capacità del batterio di riconoscere l'attacco del virus, pertanto anche se i processi di maturazione del trascritto di crRNA differiscono tra un sistema e l'altro la sua struttura contiene generalmente:
Riga 255:
==== Nei sistemi CRISPR/Cas di tipo III. ====
Richiede sei o sette proteine Cas per il legame al crRNA, analogamente ai sistemi di tipo I. I sistemi di tipo III esaminati in ''S. solfataricus'' e ''P. furiosus'' possono riconoscere il mRNA del fago (piuttosto che il suo DNA): questo rende i sistemi III capaci di riconoscere "non-self" anche sotto forma di RNA (e dunque di riconoscere anche genomi di fagi basati su RNA).
==== Nei sistemi CRISPR/Cas di tipo IV. ====
{{...|biologia}}
==== Nei sistemi CRISPR/Cas di tipo V. ====
{{...|biologia}}
==== Nei sistemi CRISPR/Cas di tipo VI. ====
{{...|biologia}}
==== Nei sistemi CRISPR/Cas di tipo VII. ====
{{...|biologia}}
==Applicazioni==
Nei malati di [[diabete mellito di tipo 1]], dopo una prova di principio<ref>{{Cita web|lingua=it-IT|url=https://www.diabete.com/diabete-1-trapianto-cellule-pancreatiche-senza-farmaci-immunosoppressori/|titolo=Diabete tipo 1 – Trapianto di cellule pancreatiche per la prima volta senza farmaci immunosoppressori|sito=Diabete.com|data=2025-08-19|accesso=2025-09-09}}</ref>, è stato dimostrato che il trapianto di cellule pancreatiche da donatore deceduto è stato capace di rilasciare insulina capace di regolare il livello di glucosio nel sangue per mesi senza la necessità di assumere farmaci immunosoppressori.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Elie|cognome=Dolgin|data=2025-09-05|titolo=Hope for diabetes: CRISPR-edited cells pump out insulin in a person — and evade immune detection|rivista=Nature|lingua=en|accesso=2025-09-09|doi=10.1038/d41586-025-02802-5|url=https://www.nature.com/articles/d41586-025-02802-5}}</ref>
== Aspetti controversi ==
{{...|biologia}}
== Note ==
Riga 272 ⟶ 286:
* [[Prime editing]] (editing all'avvio) soprannominato anche "trova e sostituisci"<ref>{{cita news| url =https://www.lescienze.it/news/2019/10/21/news/prime_il_nuovo_editing_genomico_che_reinventa_crispr-4590313/ | titolo = Prime, il nuovo editing genomico che reinventa CRISPR | pubblicazione = lescienze.it| data = 21 ottobre 2019|accesso = 22 ottobre 2019}}</ref>
* [[prime editing guide]] (peg)
* [[Tecnica CRISPR]]
== Altri progetti ==
Riga 281 ⟶ 296:
* {{cita news | nome = Sylvie | cognome = Coyaud | wkautore = Sylvie Coyaud | url = http://oggiscienza.it/2015/05/28/la-tecnica-crisprcas9-e-leugenetica/ | titolo = La tecnica CRISPR/Cas9 e l’eugenetica | rivista = OggiScienza. La ricerca e i suoi protagonisti | editore = [[SISSA|SissaLab]] | giorno = 28 | mese = maggio | anno = 2015 | accesso = 14 ottobre 2015 }}
* {{cita web | url = https://www.addgene.org/CRISPR/ | titolo = CRISPR/Cas9 Plasmids and Resources | sito = Addgene, the nonprofit plasmid repository | lingua = en | editore = guida alla tecnica CRISPR/Cas9, storia, risorse, progettazione di esperimenti | accesso = 15 ottobre 2015}}
* {{cita news |autore = [[Edoardo Boncinelli]] |
* {{cita news | url = https://www.sciencemag.org/news/2016/11/any-idiot-can-do-it-genome-editor-crispr-could-put-mutant-mice-everyones-reach | titolo = 'Any idiot can do it.' Genome editor CRISPR could put mutant mice in everyone's reach | nome = Jon | cognome = Cohen | rivista = [[Science]] | giorno = 3 | mese = novembre | anno = 2016 | lingua = en | doi = 10.1126/science.aal0334 | accesso = 28 marzo 2017 }}
| |||