ELISA (biochimica): differenze tra le versioni

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{{Disclaimer|medico}}

{{W|biologia|settembre 2010}}

{{F|procedure diagnostiche|settembre 2018}}

[[ImageFile:PSA-sandwich_3QUM.png|thumb|300pxupright=1.4|'''Struttura cristallografica che esemplifica un saggio sandwich ''ELISA'' per quantificare la concentrazione [[semenogelasi|PSA o antigene della prostata]]'''<ref name="Stura-22037582">{{citeCita journalpubblicazione | authorautore = Stura, E.A., Muller, B.H., Michel, S., Jolivet-Reynaud, C., Ducancel, F. | titletitolo = Crystal structure of human prostate-specific antigen (PSA) in a sandwich antibody complex. | journalrivista = J. Mol. Biol. | date data= 9 Decemberdicembre 2011 | url = http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611011314 | pmid = 22037582 | doi = 10.1016/j.jmb.2011.10.007 | volume = 414 | pagespp = 530-544 | issuenumero = 5 }}</ref>. (1) L'anticorpo di cattura sotto forma di [[frammento Fab]] 5D3D11 (celeste/verde) corriponderebbecorrisponderebbe all'anticorpo EzN-472 assorbito sulla placca. (2) Nella seconda fase l'antigene (marrone) viene catturato e (3) rilevato da un secondo anticorpo 5A5D5 che in un vero test sarebbe legato ad un enzima.]]

'''ELISA''' è un [[acronimo]] che è derivataderivato dall'espressione in [[lingua inglese|inglese]] '''''Enzymeenzyme-Linkedlinked ImmunoSorbentimmunosorbent Assayassay''''' ('''Saggiosaggio Immunoimmuno-Assorbenteassorbente legato ad un Enzimaenzima'''). Si tratta di un versatile metodo d'analisi immunologica usato in [[biochimica]] per rilevare la presenza di una sostanza usando uno o più [[anticorpi]] ad uno dei quali éè legato un [[enzima]]: tale metodica d'indagine rientra nella categoria dei [[test immunoenzimatico|test immunoenzimatici]]. La sostanza da rilevare puopuò essere un [[antigene]] appartenente ad un [[patogeno]] odo una [[molecola]] più piccola, chiamata [[aptene]], come per esempio per riconoscere la presenza di [[steroidi]]. Se invece di un enzima, viene usato un radionucleideradionuclide (spesso l'lo [[Radiochimica|iodio-125]]) viene usato per rilevare la positività del test, si parla di [[Dosaggio radioimmunologico|RIA]] (dall'inglese (''radio-immuno assay''). La procedura ELISA può essere suddivisa in tre fasi. Queste includono la progettazione del protocollo ELISA, l'interpretazione iniziale dei dati per l'ELISA e il calcolo dei risultati ELISA.<ref>{{Cita web|lingua=en|url=https://antiteck.com/how-to-do-elisa-test/|titolo=How To Do ELISA Test?|sito=|accesso=2025-06-10}}</ref>

Il saggio ELISA trova anche ampio uso per accertare la presenza di [[Anticorpo|anticorpi]] contro un determinato antigenoantigene nel [[plasma (biologia)|plasma sanguigno]] del paziente per accertarsi se c'è stata una un'esposizione ad un determinato patogeno. Questo avviene nel [[Test HIV|test per l'HIV]] per accertarsi se il sistema immunitario del soggetto si è trovato a confronatreconfrontare il virus dell'[[AIDS]].

[[Image:PSA-sandwich_3QUM.png|thumb|300px|'''Struttura cristallografica che esemplifica un saggio sandwich ''ELISA'' per quantificare la concentrazione [[semenogelasi|PSA o antigene della prostata]]'''<ref name="Stura-22037582">{{cite journal | author = Stura, E.A., Muller, B.H., Michel, S., Jolivet-Reynaud, C., Ducancel, F. | title = Crystal structure of human prostate-specific antigen (PSA) in a sandwich antibody complex. | journal = J. Mol. Biol. | date = 9 December 2011 | url = http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611011314 | pmid = 22037582 | doi = 10.1016/j.jmb.2011.10.007 | volume = 414 | pages = 530-544 | issue = 5 }}</ref>. (1) L'anticorpo di cattura sotto forma di frammento Fab 5D3D11 (celeste/verde) corriponderebbe all'anticorpo assorbito sulla placca. (2) Nella seconda fase l'antigene (marrone) viene catturato e (3) rilevato da un secondo anticorpo 5A5D5 che in un vero test sarebbe legato ad un enzima.]]

Ci sono diversidiverse varianti del test ELISA., Cheche si differenziano secondoa ilseconda del componente che si vuole rilevare. Nel test diretto viene determinata la presenza dell'antigene, in quello indiretto, la presenza di anticorpi contro l'antigene. Il saggio puopuò essere ''competitivo'' (o ''non competitivo''. L'ELISA COMPETITIVO)non ocompetitivo nodiretto (ELISAsi NONeffettua COMPETITIVO)secondo diverse metodiche: semplice e sandwich ELISA.

'''ELISA''' è un [[acronimo]] che è derivata dall'espressione in [[lingua inglese|inglese]] '''''Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay''''' ('''Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima'''). Si tratta di versatile metodo d'analisi immunologica usato in [[biochimica]] per rilevare la presenza di una sostanza usando uno o più [[anticorpi]] ad uno dei quali é legato un [[enzima]]. La sostanza da rilevare puo essere un [[antigene]] appartenente ad un [[patogeno]] od una [[molecola]] più piccola, chiamata [[aptene]], come per esempio per riconoscere la presenza di [[steroidi]]. Se invece di un enzima, un radionucleide (spesso l'[[Radiochimica|iodio-125]]) viene usato per rilevare la positività del test, si parla di [[Dosaggio radioimmunologico|RIA]] dall'inglese (radio-immuno assay).

[[File:ELISA diretto e sandwich.png|thumb|Test E.L.I.S.A. Diretto e Sandwich]]

Nel metodo semplice l'antigenoantigene è assorbito sulla placca e rilevato con un anticorpo marcato da un enzima. Nel medodometodo a sandwich l'anticorpo che è usato per catturare l'antigene éè assorbito sulla placca, gli anticorpi assorbiti sono in sequitoseguito esposti al fluido che potrebbe contenere l'antigene ed un secondo anticorpo, marcato, viene aggiunto per rilevare che l'antigenoantigene è stato catturato. In questo secondo caso, gli epitopi HP2 sull'antigenoantigene dei due anticorpi devono essere completamantecompletamente distinti senza alcuna sovraposizionesovrapposizione (vedi figura).

== Metodo indiretto (variante a sandwich) ==

Il saggio ELISA trova anche ampio uso per accertare la presenza di [[anticorpi]] contro un determinato antigeno nel [[plasma (biologia)|plasma sanguigno]] del paziente per accertarsi se c'è stata una esposizione ad un determinato patogeno. Questo avviene nel [[Test HIV|test per l'HIV]] per accertarsi se il sistema immunitario del soggetto si è trovato a confronatre il virus dell'[[AIDS]].

[[File:Elisa.gif|right|250px|thumb|upright=3.6|Test E.L.I.S.A. direttosandwich]]

Il metodo diretto (chiamato anche Sandwich) prevede la copertura del fondo del pozzetto con un anticorpo specifico per l'antigene che vogliamo misurare. Si esegue un lavaggio. In seguito si introduce l'antigene, che si legherà all'anticorpo. Si lava ulteriormente per togliere antigeni in eccesso o non legati. Si introduce un anticorpo specifico che legherà il complesso anticorpo + antigene, formando un triplo"terzo" strato (o "sandwich"), da cui prende il nome il test. All'ultimo anticorpo che abbiamo aggiunto, eraè legato un enzima specifico, e aggiungendo il suo substrato si formerà un prodotto colorato, che evidenzierà il pozzetto nel caso in cui sia presente l'antigene di interesse.

Ci sono diversi varianti del test ELISA. Che si differenziano secondo il componente che si vuole rilevare. Nel test diretto viene determinata la presenza dell'antigene, in quello indiretto, la presenza di anticorpi contro l'antigene. Il saggio puo essere competitivo (ELISA COMPETITIVO) o no (ELISA NON COMPETITIVO).

L'ELISA NON COMPETITIVO diretto si effetua secondo diverse metodiche: semplice e sandwich ELISA.

leLe fasi in sintesi prevedono:

Nel metodo semplice l'antigeno è assorbito sulla placca e rilevato con un anticorpo marcato da un enzima. Nel medodo a sandwich l'anticorpo che è usato per catturare l'antigene é assorbito sulla placca, gli anticorpi assorbiti sono in sequito esposti al fluido che potrebbe contenere l'antigene ed un secondo anticorpo, marcato viene aggiunto per rilevare che l'antigeno è stato catturato. In questo secondo caso, gli epitopi sull'antigeno dei due anticorpi devono essere completamante distinti senza alcuna sovraposizione.

== Metodo diretto ==

[[File:Elisa.gif|right|250px|thumb|Test E.L.I.S.A. diretto]]

Il metodo diretto (chiamato anche Sandwich) prevede la copertura del fondo del pozzetto con un anticorpo specifico per l'antigene che vogliamo misurare. Si esegue un lavaggio. In seguito si introduce l'antigene, che si legherà all'anticorpo. Si lava ulteriormente per togliere antigeni in eccesso. Si introduce un anticorpo specifico che legherà il complesso anticorpo+antigene, formando un triplo strato da cui prende il nome il test. All'ultimo anticorpo che abbiamo aggiunto, era legato un enzima specifico, e aggiungendo il suo substrato si formerà un prodotto colorato, che evidenzierà il pozzetto.

le fasi in sintesi prevedono:

# Immissione di una soluzione dell'[[anticorpo]] primario, specifico per l'[[antigene]] da ricercare ed individuare nel siero o in un dato liquido biologico, nei pozzetti di una apposita piastra da saggio in polistirene. Il fondo del pozzetto viene saturato con l'anticorpo che aderisce al fondo dei pozzetti e l'eccesso viene lavato via.

# Aggiunta, in soluzioni con diverse concentrazioni non note, dei campioni dei quali bisogna saggiare la presenza, o meno, dell'antigene caratteristico dell’organismodell'organismo patogeno e lavaggio con soluzione tampone; Ll'antigene, se presente, si lega specificamente con l'anticorpo e l'eccesso viene lavato via.

# Aggiunta dell'anticorpo secondario, che può essere rappresentato da un anticorpo anti-[[anticorpo|immunoglobilineimmunoglobuline]] umane, che possono essere ottenute da animali di grossa taglia inoculando in essi siero umano(le cui proteine sono riconosciute come antigeni estranei aldal sistema immuneimmunitario dell'animale e quindi determinano la formazione di anticorpi). Questo anticorpo viene coniugato con un enzima, tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina, e lavaggio con soluzione tampone; L'anticorpo secondario si lega selettivamente all'antigene, se presente, e l'eccesso viene lavato via. L’assenzaL'assenza dell’antigenedell'antigene specifico per l’anticorpol'anticorpo comporta che l’anticorpol'anticorpo secondario (e il relativo enzima ad esso coniugato), con il lavaggio, venga dilavato.

# AggiuntaSe dil'enzima usato è la fosfatasi alcalina si aggiunge come substrato p-nitrofenilfosfato; Questa sostanza provoca una reazione con l'enzimala coniugatofosfatasi alcalina coniugata all'anticorpo secondario producendo [[4-nitrofenolo|p-nitrofenolo]] di colore giallo. Se l’antigenel'antigene caratteristico dell’organismodell'organismo patogeno è assente nel pozzetto non vi sarà neanche l’enzimal'enzima coniugato all’anticorpoall'anticorpo secondario -e quindi la reazione non puòpotrà avvenire.

# Aggiunta di [[idrossido di sodio]] per bloccare la reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato;

# Lettura del risultato, espressione della reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato che produce sul substrato una reazione cromogenica o fluorogenica - ovvero sviluppo di [[colore]] o luce di [[fluorescenza]] - successivamente misurabile attraverso uno [[spettrofotometro]].

Lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dell'antigene che si voleva saggiare e l'intensità della colorazione, misurabile grazie al spettrofotometro, è semi-quantitativa secondo una scala arbitraria di intensità.

Al fine di validare il test, le operazioni sopra riportate vengono effettuate in due pozzetti distinti che differiscono per il tipo di anticorpo primario che viene introdotto inizialmente: un pozzetto viene riempito con l'anticorpo specifico per l'antigene che si vuole individuare, mentre l'altro viene saturato con un anticorpo non specifico.

Affinché il test possa ritenersi valido, in primo luogo deve risultare negativo in quest'ultimo pozzetto e nel caso in cui il campione biologico saggiato contenga realmente l'antigene d'interesse, il test deve essere positivo nell'altro pozzetto, quello saturato con l'anticorpo primario specifico.

Esiste anche un altro tipo di ''metodo indiretto'' nel quale sul fondo del pozzetto sono legati antigeni ai quali un [[anticorpo]] si lega in modo specifico (anticorpo primario). Questo viene quindi aggiunto al pozzetto e, dopo il lavaggio si aggiunge un altro anticorpo (anticorpo secondario) diretto contro il ''[[Frammento Fc|frammento cristallizabile]]'' (''Fc,'' catena pesante) dell'anticorpo primario. I due anticorpi sono prodotti in specie diverse, il primo ad esempio può essere prodotto in topo e il secondo in altro animale come la capra. Di norma l'anticorpo secondario è ingegnerizzato in modo da essere coniugato ad un ''marcatore'' (tag) come la [[Fosfatasi|fosfatasi alcalina]] (AP) o [[perossidasi]] (HRP) che producono da substrati specifici prodotti colorati, per cui il metodo di rilevamento risulta analogo a quanto detto sopra. L'unica differenza è che sul fondo del pozzetto non sono presenti anticorpi, ma l'antigene di interesse. Questo approccio è del tutto simile a quello adottato per il rilevamento delle bande proteiche su fogli di [[nitrocellulosa]] o [[Polivinilidenfluoruro|polivinildenfluoruro]] (PVDF) nella fase finale dello sviluppo del [[Western blot]].

Il test ELISA NON COMPETITIVO è un test qualitativo e semi-quantitativo: non fornisce un valore effettivo ma afferma la presenza o l'assenza dell'analita.

Il test ELISA COMPETITIVO è invece un test quali-quantitativo: fornisce un valore specifico con una [[deviazione standard]].

== Metodo indirettodiretto ==

Nel metodo diretto innanzitutto si copre il fondo del pozzetto con l'estratto proteico in cui potrebbe essere presente la proteina che vogliamo misurare (antigene). Si lava via l'eccesso per eliminare l'indesiderato. Si aggiunge l'anticorpo per l'antigene che probabilmente è stato adsorbito al fondo del pozzetto. Questo anticorpo è coniugato con un marcatore (tag) enzimatico, di norma [[Fosfatasi|fosfatasi alcalina]] (AP) o [[perossidasi]] (HRP: ''Horseradish Peroxidase'', perossidasi di rafano). Si lava via l'eccesso ancora una volta. Si effettua un lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legatisi all'antigene (quelli combinati resistono invece al lavaggio). Infine si aggiunge il substrato dell'enzima con cui è stato marcato l'anti-anticorpo: un cambiamento di colore indica la presenza degli antigeni nel campione, visto che l'enzima usato agisce sul substrato modificandolo, in maniera che assorba la luce e risulti colorato.[http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html] {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20120315004233/http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html |data=15 marzo 2012 }}

Ha lo scopo di ricercare specifici [[anticorpoAntigene|anticorpiantigeni]] in un dato liquido biologico avendo a disposizione [[antigeneAnticorpo|antigenianticorpi]] marcati a cui questi possano legarsi o, al contrario, per ricercare specifici [[antigene|antigeni]]anticorpi avendo a disposizione [[anticorpoAnticorpo|anticorpi]] monoclonalimarcati che possano legarsi aal [[Frammento Fc|frammento cristallizabile]] (Fc) di questi ultimi.

Il metodo indiretto invece, in via teorica, funziona così: innanzi tutto si copre il fondo del pozzetto con l'antigene specifico per l'anticorpo che vogliamo misurare. Si lava via l'eccesso per eliminare l'indesiderato. Si aggiunge il siero(campione) che si pensa contenga gli anticorpi per quell'antigene adsorbito al fondo del pozzetto. Si lava via l'eccesso ancora una volta. Si aggiunge un secondo tipo di anticorpo (marcato con un enzima), che legherà il complesso antigene(adsorbito)+anticorpo(del campione) se sono presenti gli anticorpi nel campione. Il secondo anticorpo è quindi un anti-anticorpo. Si effettua un lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legatisi al complesso (quelli combinati resistono invece al lavaggio).

Infine si aggiunge il substrato dell'enzima con cui è stato marcato l'anti-anticorpo: un cambiamento di colore indica la presenza degli anticorpi nel siero (nel campione), visto che l'enzima usato agisce sul substrato modificandolo, in maniera che assorba la luce e risulti colorato.[http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html]

Ha lo scopo di ricercare specifici [[anticorpo|anticorpi]] in un dato liquido biologico avendo a disposizione [[antigene|antigeni]] a cui questi possano legarsi o, al contrario, per ricercare specifici [[antigene|antigeni]] avendo a disposizione [[anticorpo|anticorpi]] monoclonali che possano legarsi a questi ultimi.

In caso di esito positivo, per conferma si esegue il [[Western Blot]].

== Innovazioni ==

La '''Multiple & Portable ELISA (M&P ELISA)''' (patent US 7510687 by A. Mazzeo & G. Petracca) usa una conformazione innovativa della fase solida: un’astinaun'astina di polistirene da cui protrudono 8 o 12 ogive.

L’interaL'intera astina va introdotta direttamente nel campione da saggiare e tutti i passaggi successivi (lavaggi, incubazione in coniugato e incubazione in cromogeno) sono eseguiti semplicemente immergendo le ogive dell’astinadell'astina - estratta dal campione dopo opportuna incubazione - in pozzetti di micropiastre o microstrip standard, pre-riempiti con le soluzioni e i reagenti.

Gli importanti vantaggi sono:

* l’ l'astina introdotta nel campione ha le ogive sensibilizzate con reagenti differenti, in modo che in ciascun campione sia possibile la ricerca simultanea di differenti anticorpi e/o di differenti antigeni, per analisi multiple o per multi-screening;

* il volume del campione analizzato può essere aumentato per aumentare la sensibilità del test in campioni clinici (sangue, saliva, urine), alimentari (latte di massa, pool di uova) e ambientali (acqua);

* un’ogivaun'ogiva di ogni astina non è sensibilizzata e funge da controllo negativo, per valutare la specificità per tutti i test di ricerca di anticorpi e/o antigeni eseguiti nel campione in esame;

* non si deve effettuare la distribuzione dei campioni, dei coniugati e del cromogeno nei pozzetti di micropiastra o in microstrip; i lavaggi sono estremamente semplificati;

* la tecnologia innovativa consente la realizzazione di kit da laboratorio pronti all'uso e di kit portatili per analisi in campo (ambulatori, aeroporti, dogane, allevamenti).

== Note ==

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* [[Microarray immunologico in sospensione]]

== Altri progetti ==

[[Categoria:HIV/AIDS]]

{{interprogetto}}

[[Categoria:Tecniche di laboratorio]]

[[Categoria:Acronimi]]

== Collegamenti esterni ==

[[ca:ELISA]]

* {{Collegamenti esterni}}

[[cs:ELISA]]

[[de:Enzyme-linked Immunosorbent Assay]]

{{Controllo di autorità}}

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{{Portale|biologia}}

[[es:ELISA]]

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[[Categoria:Tecniche di laboratorio]]

[[fr:Méthode immuno-enzymatique ELISA]]

[[he:ELISA]]

[[id:ELISA]]

[[ja:ELISA]]

[[ko:효소 결합 면역 침강 분석법]]

[[lt:ELISA]]

[[nl:ELISA]]

[[pl:ELISA (test immunoenzymatyczny)]]

[[pt:ELISA]]

[[ru:Иммуноферментный анализ]]

[[simple:ELISA]]

[[sl:ELISA]]

[[sr:Елиза тест]]

[[sv:Enzymkopplad immunadsorberande analys]]

[[tr:ELISA]]

[[uk:Імуноферментний аналіз]]

[[ur:ELISA]]

[[vi:ELISA]]

[[zh:酶联免疫吸附试验]]