CRISPR: differenze tra le versioni
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=== 5. Ipotesi sulla funzione di CRISPR e sulla loro genesi: la seconda ipotesi di Mojica ===
Nel 2005 tre gruppi di ricerca tra loro indipendenti dimostrarono che alcuni spaziatori presenti nei CRISPR derivavano da DNA di batteriofagi o da DNA extra-cromosomico (es. DNA di plasmidi)<ref>{{Cita pubblicazione|nome=C.|cognome=Pourcel|data=March 2005|titolo=CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies|rivista=Microbiology (Reading, England)|volume=151|numero=Pt 3|pp=653–663|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1099/mic.0.27437-0|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15758212|nome2=G.|cognome2=Salvignol|nome3=G.|cognome3=Vergnaud}}</ref><ref name="ReferenceC">{{Cita pubblicazione|nome=Francisco J. M.|cognome=Mojica|data=February 2005|titolo=Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements|rivista=Journal of Molecular Evolution|volume=60|numero=2|pp=174–182|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1007/s00239-004-0046-3|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15791728|nome2=César|cognome2=Díez-Villaseñor|nome3=Jesús|cognome3=García-Martínez}}</ref><ref name="A">{{Cita pubblicazione|nome=Alexander|cognome=Bolotin|data=August 2005|titolo=Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin|rivista=Microbiology (Reading, England)|volume=151|numero=Pt 8|pp=2551–2561|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1099/mic.0.28048-0|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16079334|nome2=Benoit|cognome2=Quinquis|nome3=Alexei|cognome3=Sorokin}}</ref>. Infatti gli spacer (spaziatori) sono piccole sequenze di DNA acquisite per mezzo di virus che hanno tentato in passato di attaccare la cellula<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Philippe|cognome=Horvath|data=8 gennaio 2010|titolo=CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea|rivista=Science (New York, N.Y.)|volume=327|numero=5962|pp=167–170|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1126/science.1179555|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20056882|nome2=Rodolphe|cognome2=Barrangou}}</ref><ref>{{Cita pubblicazione|nome=Michel|cognome=Morange|data=June 2015|titolo=What history tells us XXXVII. CRISPR-Cas: The discovery of an immune system in prokaryotes|rivista=Journal of Biosciences|volume=40|numero=2|pp=221–223|accesso=3 ottobre 2017|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25963251}}</ref>. Proprio questa osservazione suggerì un ruolo di CRISPR nell'immunità adattativa dei procarioti. Queste ricerche non vennero pubblicate su giornali scientifici con elevata peer-review, ma apparvero in altre riviste minori.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Eric S.|cognome=Lander|data=14 gennaio 2016|titolo=The Heroes of CRISPR|rivista=Cell|volume=164|numero=1-2|pp=18–28|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1016/j.cell.2015.12.041|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26771483}}</ref>
La prima ricerca che ipotizzò un ruolo di CRISPR-Cas nell'immunità adattativa venne pubblicata dal gruppo di Mojica<ref name="ReferenceC"/>. Egli ipotizzò la presenza di un sistema analogo a quello del RNAi (Rna-interference) presente negli eucarioti; in altre parole il locus CRISPR poteva riconoscere gli attacchi da virus esogeni mediante la seguente strategia:
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Parallelamente a ciò vennero proposte altre due ipotesi da altri ricercatori che tentavano di spiegare la funzione di CRISPR nei procarioti:
* Koonin e colleghi estesero l'ipotesi di Mojica (sistema analogo al Rna-interference degli eucarioti) ai geni CAS ed elencarono i diversi meccanismi di azione dei diversi sottotipi dei sistemi Cas-CRISPR;<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Kira S.|cognome=Makarova|data=16 marzo 2006|titolo=A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action|rivista=Biology Direct|volume=1|pp=7|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1186/1745-6150-1-7|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16545108|nome2=Nick V.|cognome2=Grishin|nome3=Svetlana A.|cognome3=Shabalina}}</ref>
* Altri ricercatori ipotizzarono che le sequenze CRISPR indirizzavano in qualche modo gli enzimi CAS a degradare il DNA Virale.<ref name="Patrick D 2014">{{Cita pubblicazione|nome=Patrick D.|cognome=Hsu|data=5 giugno 2014|titolo=Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering|rivista=Cell|volume=157|numero=6|pp=1262–1278|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1016/j.cell.2014.05.010|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24906146|nome2=Eric S.|cognome2=Lander|nome3=Feng|cognome3=Zhang}}</ref><ref
=== 6. Dalle ipotesi di Mojica alle prime scoperte definitive ===
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# Una regione CRISPR di [[Streptococcus thermophilus]] acquisì delle sequenze di DNA-spacer per mezzo dell'invasione di un [[batteriofago]];
# Si aggiungevano e rimuovevano DNA-spacer dalla sequenza conosciuta e uguale a quella acquisita dal batterio per mezzo del [[batteriofago]];
# Si osservava che [[Streptococcus thermophilus]] diventava "resistente" al batteriofago se si aggiungeva un DNA-spacer simile a quello del [[batteriofago]].<ref name="B">{{Cita pubblicazione|nome=Luciano A.|cognome=Marraffini|data=1º ottobre 2015|titolo=CRISPR-Cas immunity in prokaryotes|rivista=Nature|volume=526|numero=7571|pp=55–61|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1038/nature15386|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26432244}}</ref><ref>{{Cita pubblicazione|nome=Elizabeth|cognome=Pennisi|data=23 agosto 2013|titolo=The CRISPR craze|rivista=Science (New York, N.Y.)|volume=341|numero=6148|pp=833–836|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1126/science.341.6148.833|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23970676}}</ref>
Nel 2008, Brouns e colleghi identificarono in [[Escherichia coli|E.Coli]] un complesso di proteine Cas che tagliava il trascritto di RNA del locus CRISPR (CRISPR-RNA) per ottenere due tipi di frammenti:
# frammenti di RNA che contenevano soltanto le sequenze ripetute;
# frammenti di RNA che contenevano soltanto le sequenze spacer, che rimanevano ancorati al complesso proteico Cas.
Sempre nel 2008 Marraffini e Sontheimer dimostrarono che una sequenza CRISPR di ''S. epidermidis'', per prevenire l'invasione di un batteriofago ([[Coniugazione batterica|coniugazione]]), agiva contrastando il suo DNA e non il suo RNA. Questa ipotesi si discostava da quella dell'RNAinterference di Mojica, che allo stesso momento veniva confermata dal sistema CRISPR-Cas di [[Pyrococcus furiosus]] che preveniva l'infezione riconoscendo l'RNA del non-self.<ref name="Patrick D 2014"/><ref
Nel 2010 uno studio ha dimostrato che in ''S. thermophilus'' il sistema CRISPR-Cas tagliava entrambi i filamenti del fago e del DNA del plasmide.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Josiane E.|cognome=Garneau|data=4 novembre 2010|titolo=The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA|rivista=Nature|volume=468|numero=7320|pp=67–71|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1038/nature09523|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21048762|nome2=Marie-Ève|cognome2=Dupuis|nome3=Manuela|cognome3=Villion}}</ref>
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== Struttura del locus CRISPR ==
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Una CRISPR è costituita da una sequenza leader seguita da brevi ripetizioni di DNA che sono separate tra loro mediante degli spaziatori o spacers, altre sequenze di DNA dalla sequenza unica e non ripetuta.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Frank|cognome=Hille|data=5 novembre 2016|titolo=CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance|rivista=Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences|volume=371|numero=1707|accesso=2 ottobre 2017|doi=10.1098/rstb.2015.0496|url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5052741/|nome2=Emmanuelle|cognome2=Charpentier}}</ref> Al locus CRISPR possono essere associati i geni cas descritti in seguito.
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=== Componente 2: Ripetizioni ===
Le ripetizioni in un locus CRISPR hanno una grandezza variabile: solitamente oscillano dai 28 ai 37 bp (base-pairs), anche se sono state scoperte delle ripetizioni molto più corte (23 bp) e molto più lunghe (55bp).<ref name="C">{{Cita pubblicazione|nome=Rodolphe|cognome=Barrangou|data=24 aprile 2014|titolo=CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity|rivista=Molecular Cell|volume=54|numero=2|pp=234–244|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1016/j.molcel.2014.03.011|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24766887|nome2=Luciano A.|cognome2=Marraffini}}</ref>
Alcune delle ripetizioni sono palindrome; ne consegue che quando sono trascritte formano un RNA che assume una struttura secondaria "a forcina".
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=== Componente 3: Spaziatore (DNA-Spacer) ===
La grandezza degli spacer nei diversi moduli CRISPR oscilla dai 21 ai 72 bps<ref
Gli spacer derivano dal "patogeno" che ha tentato in passato di infettare il batterio. Nuovi spacer pertanto possono apparire in maniera molto rapida per favorire la risposta immunitaria adattativa in seguito all'infezione del patogeno, per esempio batteriofago.<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Gene W.|cognome=Tyson|data=January 2008|titolo=Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses|rivista=Environmental Microbiology|volume=10|numero=1|pp=200–207|accesso=3 ottobre 2017|doi=10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17894817|nome2=Jillian F.|cognome2=Banfield}}</ref>
Il numero degli spacer per ogni array-CRISPR è solitamente minore di 50 unità.<ref
=== Componente 4 (opzionale, ma frequente): geni CAS ===
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