Western blot: differenze tra le versioni

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* Anticorpo primario

Gli anticorpi primari sono generati quando la specie ospite o le colture di [[cellule]] immunitarie sono esposti alla [[proteina]] di interesse (o parte ad essa vicina). Normalmente questo è parte della risposta immunitaria, dove coltivati e usati come dispositivi specifici di rilevamento che legano la proteina direttamente. Dopo il ''blocking'', una soluzione diluita di anticorpo primario (generalmente tra 0.5 e 5 μgµg/ml) è incubato con la membrana agitandolo delicatamente. Tipicamente, la soluzione è composta da una soluzione tampone con una piccola percentuale di detergente, e qualche volta con [[latte in polvere]] o [[BSA]]. La soluzione anticorpo e la membrana possono essere sigillate e incubate assieme per 30 minuti o una notte intera. Può inoltre essere incubata a differenti temperature (a temperature più calde si associano legami più forti) sia sulla specifica [[proteina]] (target, il "[[segnale]]") e non-specifica ("[[rumore]]").

* Anticorpo secondario

Dopo il risciacquo della membrana per rimuovere l'anticorpo primario non legato, alla membrana è associato un altro anticorpo, diretto a una specifica specie di anticorpo primario. Anticorpi provengono da animali (o colture ibride di provenienza animale, [[ibridoma|ibridomi]]), un anticorpo secondario del topo si legherà a qualsiasi anticorpo primario di topo, permettendo risparmi sui costi, consentendo a un intero laboratorio di condividere una unica fonte di anticorpo prodotto, e fornisce risultati migliori. Questo è conosciuto come anticorpo secondario, e data le sue proprietà bersaglio, ci si riferisce a "anti-topo," "anti-capra," etc. L'anticorpo secondario è legato solitamente alla [[biotina]] o all'[[enzima]] messaggero come [[fosfatasi|fosfatasi alcalina]] o [[Armoracia rusticana|perossidasi Armoracia rusticana]]. Questo significa che diversi anticorpi secondari si legheranno a un anticorpo primario, aumentando il segnale. Comunemente, un legame-[[Armoracia rusticana|perossidasi Armoracia rusticana]] secondario è usato per dividere un agente [[chemiluminescenza|chemiluminescente]], e la reazione prodotta emette [[luminescenza]] proporzionale all'ammontare di proteina. Una [[pellicola fotografica]] è posta contro la membrana; esposta alla luce della reazione crea un'immagine di anticorpi legato al blot. Un sistema più economico utilizza un colorante 4-cloronaftolo all'1% di [[perossido di idrogeno]]; la reazione di radicali perossido con il 4-cloronaftolo produce colore porpora scuro, permettendo la [[fotografia]] senza l'utilizzo di [[pellicole]] specifiche.