Western blot: differenze tra le versioni

Versione delle 10:31, 11 gen 2016

Versione delle 00:58, 23 feb 2016

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=== Bloccaggio ===

Dopo aver scelto la membrana per la capacità di legare la proteina, come anticorpi e proteine bersaglio, è necessario prevenire le interazioni tra la membrana e l'anticorpo usato per rilevare la proteina bersaglio. Il bloccaggio di legami non specifici è raggiunto ponendo la membrana in una soluzione diluita di proteina - tipicamente 3-5% [[Bovine serum albumin]] (BSA) o [[latte in polvere]] in [[Tris-Buffered Saline]] (TBS), con una piccola percentuale di detergente come [[Tween 20]] o [[Triton X-100]]. La proteina nella soluzione diluita attecchisce alla membrana in tutti i punti dove le proteine bersaglio non hanno attecchito. Questo permette, quando l'anticorpo è aggiunto, di non avere spazio sulla membrana per esso, perché già occupati dalla proteina specifica. Questo riduce il "[[rumore]]" nel prodotto finale, portando risultati più puliti, e eliminando falsi positivi.

=== Rilevamento ===

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==== Two-step ====

* Anticorpo primario

Gli anticorpi primari sono generati quando la specie ospite o le colture di [[cellule]] immunitarie sono esposti alla [[proteina]] di interesse (o parte ad essa vicina). Normalmente questo è parte della risposta immunitaria, dove coltivati e usati come dispositivi specifici di rilevamento che legano la proteina direttamente. Dopo il ''blocking'', una soluzione diluita di anticorpo primario (generalmente tra 0.5 e 5 µg/ml) è incubato con la membrana agitandolo delicatamente. Tipicamente, la soluzione è composta da una soluzione tampone con una piccola percentuale di detergente, e qualche volta con [[latte in polvere]] o [[BSA]]. La soluzione anticorpo e la membrana possono essere sigillate e incubate assieme per 30 minuti o una notte intera. Può inoltre essere incubata a differenti temperature (a temperature più calde si associano legami più forti) sia sulla specifica [[proteina]] (target, il "[[segnale]]") e non-specifica ("[[rumore]]").

* Anticorpo secondario

Dopo il risciacquo della membrana per rimuovere l'anticorpo primario non legato, alla membrana è associato un altro anticorpo, diretto a una specifica specie di anticorpo primario. Anticorpi provengono da animali (o colture ibride di provenienza animale, [[ibridoma|ibridomi]]), un anticorpo secondario del topo si legherà a qualsiasi anticorpo primario di topo, permettendo risparmi sui costi, consentendo a un intero laboratorio di condividere una unica fonte di anticorpo prodotto, e fornisce risultati migliori. Questo è conosciuto come anticorpo secondario, e data le sue proprietà bersaglio, ci si riferisce a "anti-topo," "anti-capra," etc. L'anticorpo secondario è legato solitamente alla [[biotina]] o all'[[enzima]] messaggero come [[fosfatasi|fosfatasi alcalina]] o [[Armoracia rusticana|perossidasi Armoracia rusticana]]. Questo significa che diversi anticorpi secondari si legheranno a un anticorpo primario, aumentando il segnale. Comunemente, un legame-[[Armoracia rusticana|perossidasi Armoracia rusticana]] secondario è usato per dividere un agente [[chemiluminescenza|chemiluminescente]], e la reazione prodotta emette [[luminescenza]] proporzionale all'ammontare di proteina. Una [[pellicola fotografica]] è posta contro la membrana; esposta alla luce della reazione crea un'immagine di anticorpi legato al blot. Un sistema più economico utilizza un colorante 4-cloronaftolo all'1% di [[perossido di idrogeno]]; la reazione di radicali perossido con il 4-cloronaftolo produce colore porpora scuro, permettendo la [[fotografia]] senza l'utilizzo di [[pellicole]] specifiche.

[[File:Western Blot binding.png|center]]

Come con l'[[ELISPOT]] e l'[[ELISA]], l'enzima può essere dato da un substrato di molecole che può essere convertito dall'enzima in una prodotto di reazione colorata visibile sulla membrana (vedi le bande blu nella figura sotto). Un altro metodo con anticorpo secondario rilevatore utilizza un anticopro fluoro-legato al vicino-[[infrarosso]] ([[NIR]]). La luce prodotta dall'eccitazione del colorante fluorescente è statica, permettendo un rilevamento accurato delle differenze di segnale prodotte da anticorpi etichetta legati a proteine sul western blot. Le proteine possono essere quantificate perché il segnale generato dalla differenza di quantità di proteine sulle membrane è misurata in modo statico, comparato alla [[chemiluminescenza]], ove la luce è misurata in stato dinamico.<ref name=Ambroz2006/>

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== Note ==

<references>

<ref name=Ambroz2006>{{Cita pubblicazione |titolo=Improving quantification accuracy for western blots |autore=Ambroz K. |rivista=Image Analysis |data=20 settembre 2006 |url=http://www.licor.com./bio/QuantitativeWesterns/pdf/bt0609_LI-COR_final.pdf |formato=PDF}}</ref>

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<ref name="urlExactantigen">{{Cita web|url=http://www.exactantigen.com/review/western-blot-antibody.html | titolo=Western blot antibody |accesso=29 gennaio 2009 |sito=exactantigen.com}}</ref>

<references>

</references>

== Voci correlate ==

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* [[Northern blot]]

* [[Southern blot]]

== Altri progetti ==

{{interprogetto|b=Laboratorio/Western blot|b_etichetta=la tecnica del western Blot}}

== Collegamenti esterni ==

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* {{cita web|http://www.prosci-inc.com/Western-Blot-Protocol.html|Western blot protocol including example buffers and reprobing procedure}}

== Altri progetti ==

{{interprogetto|b=Laboratorio/Western blot|b_etichetta=la tecnica del western Blot}}

{{Elettroforesi}}

{{Chimica elettroanalitica}}