Real time PCR: differenze tra le versioni
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Per alcuni geni bersaglio, le impostazioni degli inneschi e le condizioni ottimizzate sono state raccolte in alcuni database ([http://www.realtimeprimers.org/ http://www.realtimeprimers.org]) per facilitare lo sviluppo delle analisi. In una reazione tipica, il prodotto di PCR si raddoppia ad ogni ciclo dell'amplificazione. Siccome sono necessari parecchi cicli affinché abbastanza prodotto sia rilevabile, il diagramma della fluorescenza sul numero dei cicli esibisce un andamento sigmoide. Nei cicli finali, i substrati di reazione iniziano a scarseggiare, i prodotti di PCR non raddoppiano e la curva comincia ad appiattirsi. Il punto sulla curva in cui la quantità di fluorescenza comincia ad aumentare velocemente, solitamente alcuni scarti quadratici medi sopra la linea di base, è chiamato il ciclo soglia (valore di Ct). Il diagramma di Ct su DNA stampo è lineare, così un confronto dei valori di Ct fra reazioni multiple permette di calcolare la concentrazione dell'acido nucleico che si vuole quantificare. La pendenza di questa linea fornisce inoltre una misura dell'efficienza della PCR. Alcuni strumenti permettono agli utenti di generare delle curve di [[denaturazione del DNA|melting]] che seguono il completamento della PCR. Le curve di melting forniscono un'indicazione della purezza del prodotto di reazione e rivelano la presenza di dimeri degli inneschi.
==Marcatura fluorescente==
== Intercalanti fluorescenti ==▼
Può essere effettuata attraverso l'uso di due diverse tecnologie:
*Intercalanti fluorescenti, ovvero molecole che si insinuano in qualche modo nella doppa elica di DNA e donano una colorazione visibile in fluorescenza
*Sonde fluorescenti, ovvero costrutti oligonucleotidici sintetici in grado di donare selettivamente la fluorescenza ai segmenti amplificati
▲=== Intercalanti fluorescenti ===
Per valutare in tempo reale la quantità di DNA a doppio filamento presente dopo ogni ciclo di sintesi, nella miscela di reazione è presente il [[SYBR Green]], un composto fluorescente intercalante del DNA. La fluorescenza del SYBR Green aumenta considerevolmente nel momento in cui la molecola si intercala nel solco minore del DNA a doppio filamento, pertanto, la misura quantitativa della fluorescenza emessa è direttamente proporzionale alla quantità di DNA a doppio filamento presente in ogni campione (che è, a sua volta, proporzionale alla quantità di DNA presente nel campione iniziale), a patto che la molecola intercalante sia presente in eccesso. La lettura della fluorescenza avviene al termine di ogni ciclo di amplificazione. L'uso di molecole fluorescenti intercalanti è un metodo efficace e relativamente economico, tuttavia questo sistema non è in grado di discriminare tra i prodotti specifici di amplificazione e altri prodotti aspecifici, come dimeri di primer.
=== Reporter a sonde fluorescenti ===
L'utilizzo di sonde rivelatrici di fluorescenza è il più accurato e il più affidabile dei metodi, ma anche il più costoso.
Esso utilizza un RNA a sequenza specifica o una sonda basata su DNA per quantificare solamente il DNA contenente la sequenza della sonda; quindi, l'uso di una sonda rivelatrice incrementa significativamente la specificità, e permette la quantificazione regolare in presenza di prodotti di amplificazione non specifici (i coloranti fluorescenti, come ad esempio il SYBR Green, rivelano l'amplificazione di qualsiasi frammento di DNA). Un comune esempio è rappresentato dal metodo [[TaqMan]] e dai [[Faro molecolare|fari molecolari]].
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