Next Generation Sequencing: differenze tra le versioni
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Il primo step è estrarre gli acidi nucleici dal materiale di partenza (vettore o genoma da cellula). A tal fine esistono in commercio dei kit.
;FRAMMENTAZIONE
;[[File:Vz r4 OY9M0 (1).jpg|miniatura|Il DNA viene stratto dal materiale di partenza utilizzando dei kit commerciali]]FRAMMENTAZIONE▼
Dopo l’estrazione degli acidi nucleici avviene la frammentazione o taglio del DNA, esistono tre metodi differenti di frammentazione:
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*'''Frammentazione enzimatica''' basata sull’utilizzo di trasposasi ingegnerizzate
*'''Nebulizzazione''' in questo caso Il DNA viene fatto passare attraverso piccoli fori applicando un’alta pressione
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I frammenti ottenuti possono avere le estremità overhangs al -5’ e al -3’ che vanno modificate in delle estremità blunt. Per fare questo possiamo adottare due strategie:
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Viene '''adenilata l’estremità -3’''' mediante l’addizione di una singola A. Questo può essere fatto mediante l’utilizzo di una '''Taq [[polimerasi]]'''<ref>{{Cita web|url=https://sciencing.com/role-taq-polymerase-pcr-7298417.html|titolo=The Role of Taq Polymerase in PCR|sito=Sciencing|lingua=en|accesso=2018-03-03}}</ref> o mediante altri enzimi come le '''[[transferasi]] terminali''' che permettono l’aggiunta di un singolo nucleotide all’estremità -3'. La corrispondente T è presente all’estremità -3’ dell’adattatore e ciò permette la formazione di due legami a idrogeno tra le due basi complementari e la conseguente ligazione.
'''AMPLIFICAZIONE TRAMITE PCR'''
La prima cosa da fare è arricchire (amplificare) perché il frammento di DNA può essere presente in una copia massimo due. Ovviamente è un po’ poco anche se il trend è quello di andare verso il single cell analysis.La cosa importante è che gli inserti si possano legare sulla slide ovvero la piastra (noi parliamo di Illumina che è quello più famoso e maggiormente descritto). Sulla piastra gli oligo vengono sintetizzati con la tecnologia dei microarray. Per l'ibridazione è necessario che gli oligo presenti sulla piastra (flow-cell) si appaino con i frammenti da sequenziare. A tal fine esistono i frammenti '''P5''' e '''P7''' adesi alla flow-cell che sono complementari ai frammenti P5 e P7 presenti sui filamenti del DNA da sequenziare. (P5 e P7 sono le regioni che permetto di ancorare il nostro frammento alla slide e sono anche utilizzati come primer per l’amplificazione)
Dopo aver fatto avvenire l’ibridazione può iniziarela reazione di PCR. Al termine della PCR dove c’era un frammento ibridato ora ce ne sono milioni. Questo processo prende il nome di '''Cluster Amplification'''. Il cluster al suo interno avrà l’inserto specifico e all’interno di un cluster la sequenza interna sarà la stessa, o meglio ci saranno le due sequenze complementari dell’inserto. Quindi alla fine della PCR arriviamo ad avere dei cluster e da una copia del DNA di partenza ottengo molteplici copie. Questa è l’amplificazione, per ora non è stato sequenziato ancora niente ma è stato preparato il materiale da sequenziare.[[File:Oligonucleotide chains in Flow Cell.png|miniatura|Una flow-cell con frammenti P5 e P7 in verde e rosa]]'''SEQUENZIAMENTO'''▼
▲Dopo aver fatto avvenire l’ibridazione può iniziarela reazione di PCR. Al termine della PCR dove c’era un frammento ibridato ora ce ne sono milioni. Questo processo prende il nome di '''Cluster Amplification'''. Il cluster al suo interno avrà l’inserto specifico e all’interno di un cluster la sequenza interna sarà la stessa, o meglio ci saranno le due sequenze complementari dell’inserto. Quindi alla fine della PCR arriviamo ad avere dei cluster e da una copia del DNA di partenza ottengo molteplici copie. Questa è l’amplificazione, per ora non è stato sequenziato ancora niente ma è stato preparato il materiale da sequenziare.
Il cluster appena formato serve per avere milioni di sequenze vicine e identiche posizionate sulla flow-cell. A questo punto si utilizzano due primers che sono '''Rd1 SP''' e '''Rd2 SP''' (SP= ''sequencing primer'') i quali permetteranno alla DNA polimerasi di procedere con la sintesi di nucleotidi. Ad ogni nucleotide aggiunto corrisponde una particolare emissione di fluorescenza, un detector registra la fluorescenza emessa in ogni punto della flow-cell, e un sistema di output fornisce la sequenza esatta dei nucleotidi. ▼
▲Il cluster appena formato serve per avere milioni di sequenze vicine e identiche posizionate sulla flow-cell. A questo punto si utilizzano due primers che sono '''Rd1 SP''' e '''Rd2 SP''' (SP= ''sequencing primer'') i quali permetteranno alla DNA polimerasi di procedere con la sintesi di nucleotidi. Ad ogni nucleotide aggiunto corrisponde una particolare emissione di fluorescenza, un detector registra la fluorescenza emessa in ogni punto della flow-cell, e un sistema di output fornisce la sequenza esatta dei nucleotidi. [[File:DNA Nanoball sequencing flow cell.jpg|miniatura|Ad ogni colore corrisponde una diversa base che viene aggiunta dalla DNA polimerasi.]]
== Note ==
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