Next Generation Sequencing: differenze tra le versioni

Versione delle 18:43, 3 mar 2018

Versione delle 18:54, 3 mar 2018

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Con il termine '''Next Generation Sequencing''' (NGS)<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Jorge S.|cognome=Reis-Filho|data=2009-01-01|titolo=Next-generation sequencing|rivista=Breast Cancer Research|volume=11|numero=3|pp=S12|accesso=2017-03-31|doi=10.1186/bcr2431|url=http://dx.doi.org/10.1186/bcr2431}}</ref> <ref>{{Cita pubblicazione|nome=Gert|cognome=Matthijs|data=2016-01-01|titolo=Guidelines for diagnostic next-generation sequencing|rivista=European Journal of Human Genetics|volume=24|numero=1|pp=2–5|lingua=en|accesso=2017-03-31|doi=10.1038/ejhg.2015.226|url=http://www.nature.com/ejhg/journal/v24/n1/full/ejhg2015226a.html|nome2=Erika|cognome2=Souche|nome3=Mariëlle|cognome3=Alders}}</ref> o ''sequenziamento in parallelo'' si indicano una serie di tecnologie che permettono di sequenziare grandi [[Genoma|genomi]] in un tempo ristretto, dell'ordine di settimane. La tecnologia più utilizzata per il NGS permette di leggere fino a 300 bp per frammento.

==Metodologia==

L’impiego di queste tecniche innovative permette, in un solo esperimento, di effettuare studi di vario genere tra i quali la caratterizzazione simultanea di genomi, individuazione di riarrangiamenti cromosomici bilanciati e sbilanciati, delezioni e copy number variations (CNV).

Il NGS viene anche definito come metodo “da estensione” perché la base viene identificata durante l’aggiunta alla catena nascente. In breve potremmo riassumere il processo partendo da [[DNA]] a singolo filamento, un primer, la DNA polimerasi e singoli nucleotidi marcati. Una volta iniziata la reazione di sintesi di DNA a doppio filamento, ogni volta che la DNA polimerasi inserisce un [[nucleotide]] sulla catena in allungamento, questo viene detectato immediatamente in quanto viene rilasciato un segnale di fluorescenza specifico per ognuno dei nucleotidi.

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Ad oggi per il NGS ci sono diverse tecniche che si basano su principi differenti.

#ILLUMINAIllumina: fluorescent sequencing

#LIFELife TECHNOLOGIESTechnologies: «pH» sequencing, si basa sulla variazione del pH che avviene quando viene incorporato un nucleotide

#ROCHERoche PARALLELParallel PYROSEQUENCINGPyrosequencing questo metodo è stato dismesso a partire dal 2015 perché era meno efficiente dei metodi basati sulla fluorescenza.

# PACIFICPacific BIOSCIENCESBioscences SMRT (Single molecule, real time) questa tecnologia non è ancora matura

#OxfOXFORD NANOPOREOxford Nanonopore rappresenta il futuro e non è ancora disponibile per i laboratori.

Le tecniche di NGS permettono di sequenziare:

<u>*DNA GENOMICO</u>genomico:

**Intero genoma (la sequenza completa - piccoli genomi)

**Esoma (solo la parte di DNA trascritto in RNA, esoni)

**Geni mirati

**Ampliconi (solo prodotti [[Reazione a catena della polimerasi|PCR]])

*Trascrittoma:

**RNA totale

**mRNA

**small RNA (<30 nt)

*Epigenoma:

**ChIP-Seq (''Chromatin immunoprecipitation sequencing'': DNA o RNA a cui sono legati specifiche proteine)

**Metil-Seq (studio del pattern di metilazione del DNA, [[epigenetica]])

Tutti questi metodi necessitano della preparazione degli acidi nucleici che devono essere sequenziati. Questa preparazione è richiesta per avere l'acido nucleico puro, delle dimensioni corrette, pronto per essere sequenziato. Questo step di preparazione viene anche chiamato ''library preparation''.

<u>TRASCRITTOMA</u>

*RNA totale

*mRNA

*small RNA (<30 nt)

<u>EPIGENOMA</u>

*ChIP-Seq (''Chromatin immunoprecipitation sequencing'': DNA o RNA a cui sono legati specifiche proteine)

*Metil-Seq (studio del pattern di metilazione del DNA, [[epigenetica]])

Tutti questi metodi necessitano della preparazione degli acidi nucleici che devono essere sequenziati. Questa preparazione è richiesta per avere l'acido nucleico puro, delle dimensioni corrette, pronto per essere sequenziato. Questo step di preparazione viene anche chiamato library preparation

Una DNA library è una collezione di frammenti di DNA identificare e selezionare i frammenti di DNA che li interessano per un ulteriore studio.

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Nel target capture si sequenzia solo parte del genoma (ad esempio un gene candidato per una specifica patologia), in questo caso la NGS è molto utile se abbiamo un centinaio di geni candidati, diversamente da altre tecniche come la DGGE (''Denaturing Gradient Gel Electrophoresis'') che in questo caso richiederebbe lo svolgimento di un esperimento per ogni singolo esone da analizzare.

[[File:Vz r4 OY9M0 (1).jpg|miniatura|Il DNA viene stratto dal materiale di partenza utilizzando dei kit commerciali]]'''END REPAIR'''

;ESTRAZIONE DEL DNA

Il primo step è estrarre gli acidi nucleici dal materiale di partenza (vettore o genoma da cellula). A tal fine esistono in commercio dei kit.

;FRAMMENTAZIONE

Dopo l’estrazione degli acidi nucleici avviene la frammentazione o taglio del DNA, esistono tre metodi differenti di frammentazione:

*'''Frammentazione fisica''' basata sull'utilizzo di ultrasuoni

*'''Frammentazione enzimatica''' basata sull’utilizzo di trasposasi ingegnerizzate

*'''Nebulizzazione''' in questo caso Il DNA viene fatto passare attraverso piccoli fori applicando un’alta pressione

[[File:Vz r4 OY9M0 (1).jpg|miniatura|Il DNA viene stratto dal materiale di partenza utilizzando dei kit commerciali]]'''END REPAIR'''

I frammenti ottenuti possono avere le estremità overhangs al -5’ e al -3’ che vanno modificate in delle estremità blunt. Per fare questo possiamo adottare due strategie:

* '''DNA polimerasi I''': dal momento che è dotata di attività esonucleasica 3’-5’, i frammenti di DNA con l’estremità 5’ overhang possono essere smussati aggiungendo un dNTP al -3’ e le sporgenze al -3’ possono essere rimosse per attività esonucleasica 3' --> 5';

* '''Mung Bean Nuclease''': i nucleotidi terminali non appaiati ad una estremità di DNA possono essere rimossi da questo singolo enzima specifico dotato di attività esonucleasica che idrolizza un legame fosfodiestere terminale, eliminando così la base “in eccesso” una alla volta.

'''SELEZIONE DEI FRAMMENTI SECONDO LE DIMENSIONI'''

A questo punto è necessario separare i frammenti in base alla loro dimensione: la tecnologia Illumina permette di sequenziare fino a '''500 bp''' per singola corsa per questo motivo sono ideali frammenti di DNA con dimensione comprese tra '''350-500 bp'''. Per ottenere frammenti della dimensione corretta si utilizzano dei kit commerciali.

I frammenti vengono messi in un buffer con un rapporto differente di Sample Purification Beads '''SPB''' e '''PEG''' che ne permette la separazione. I primi ad essere rimossi sono i frammenti più lunghi e poi quelli più corti che vengono lavati via. Per separare questi frammenti si utilizzano [https://www.sepmag.eu/blog/magnetic-dna-purification-history-recent-developments magnetic beads]<ref>{{Cita news|lingua=en-us|nome=Lluis|cognome=Martinez|url=https://www.sepmag.eu/blog/magnetic-dna-purification-history-recent-developments|titolo=Magnetic DNA Purification: History and recent developments|accesso=2018-03-03}}</ref>.

'''A-TAILING'''

Viene '''adenilata l’estremità -3’''' mediante l’addizione di una singola A. Questo può essere fatto mediante l’utilizzo di una '''Taq [[polimerasi]]'''<ref>{{Cita web|url=https://sciencing.com/role-taq-polymerase-pcr-7298417.html|titolo=The Role of Taq Polymerase in PCR|sito=Sciencing|lingua=en|accesso=2018-03-03}}</ref> o mediante altri enzimi come le '''[[transferasi]] terminali''' che permettono l’aggiunta di un singolo nucleotide all’estremità -3'. La corrispondente T è presente all’estremità -3’ dell’adattatore e ciò permette la formazione di due legami a idrogeno tra le due basi complementari e la conseguente ligazione.

'''AMPLIFICAZIONE TRAMITE PCR'''

* Estrazione del DNA: Il primo step è estrarre gli acidi nucleici dal materiale di partenza (vettore o genoma da cellula). A tal fine esistono in commercio dei kit.

La prima cosa da fare è arricchire (amplificare) perché il frammento di DNA può essere presente in una copia massimo due. Ovviamente è un po’ poco anche se il trend è quello di andare verso il single cell analysis.La cosa importante è che gli inserti si possano legare sulla slide ovvero la piastra (noi parliamo di Illumina che è quello più famoso e maggiormente descritto). Sulla piastra gli oligo vengono sintetizzati con la tecnologia dei microarray. Per l'ibridazione è necessario che gli oligo presenti sulla piastra (flow-cell) si appaino con i frammenti da sequenziare. A tal fine esistono i frammenti '''P5''' e '''P7''' adesi alla flow-cell che sono complementari ai frammenti P5 e P7 presenti sui filamenti del DNA da sequenziare. (P5 e P7 sono le regioni che permetto di ancorare il nostro frammento alla slide e sono anche utilizzati come primer per l’amplificazione)

* Frammentazione: Dopo l’estrazione degli acidi nucleici avviene la frammentazione o taglio del DNA, esistono tre metodi differenti di frammentazione:

Dopo aver fatto avvenire l’ibridazione può iniziarela reazione di PCR. Al termine della PCR dove c’era un frammento ibridato ora ce ne sono milioni. Questo processo prende il nome di '''Cluster Amplification'''. Il cluster al suo interno avrà l’inserto specifico e all’interno di un cluster la sequenza interna sarà la stessa, o meglio ci saranno le due sequenze complementari dell’inserto. Quindi alla fine della PCR arriviamo ad avere dei cluster e da una copia del DNA di partenza ottengo molteplici copie. Questa è l’amplificazione, per ora non è stato sequenziato ancora niente ma è stato preparato il materiale da sequenziare.[[File:Oligonucleotide chains in Flow Cell.png|miniatura|Una flow-cell con frammenti P5 e P7 in verde e rosa]]'''SEQUENZIAMENTO'''

*'''*Frammentazione fisica''' basata sull'utilizzo di ultrasuoni

*'''*Frammentazione enzimatica''' basata sull’utilizzo di trasposasi ingegnerizzate

*'''* Nebulizzazione''': in questo caso Il DNA viene fatto passare attraverso piccoli fori applicando un’alta pressione

* End repair: I frammenti ottenuti possono avere le estremità overhangs al -5’ e al -3’ che vanno modificate in delle estremità blunt. Per fare questo possiamosi possono adottare due strategie:

** '''DNA polimerasi I''': dal momento che è dotata di attività esonucleasica 3’-5’, i frammenti di DNA con l’estremità 5’ overhang possono essere smussati aggiungendo un dNTP al -3’ e le sporgenze al -3’ possono essere rimosse per attività esonucleasica 3' --> 5';

** '''Mung Bean Nuclease''': i nucleotidi terminali non appaiati ad una estremità di DNA possono essere rimossi da questo singolo enzima specifico dotato di attività esonucleasica che idrolizza un legame fosfodiestere terminale, eliminando così la base “in eccesso” una alla volta.

A*Selezione questodei frammenti secondo le dimensioni: In questa puntofase è necessario separare i frammenti in base alla loro dimensione: la tecnologia Illumina permette di sequenziare fino a '''500 bp''' per singola corsa per questo motivo sono ideali frammenti di DNA con dimensione comprese tra '''350-500 bp'''. Per ottenere frammenti della dimensione corretta si utilizzano dei kit commerciali.

:I frammenti vengono messi in un buffer con un rapporto differente di Sample Purification Beads '''SPB''' e '''PEG''' che ne permette la separazione. I primi ad essere rimossi sono i frammenti più lunghi e poi quelli più corti che vengono lavati via. Per separare questi frammenti si utilizzano [https://www.sepmag.eu/blog/magnetic-dna-purification-history-recent-developments magnetic beads]<ref>{{Cita news|lingua=en-us|nome=Lluis|cognome=Martinez|url=https://www.sepmag.eu/blog/magnetic-dna-purification-history-recent-developments|titolo=Magnetic DNA Purification: History and recent developments|accesso=2018-03-03}}</ref>.

*A-tailing: Viene '''adenilata l’estremità -3’''' mediante l’addizione di una singola A. Questo può essere fatto mediante l’utilizzo di una '''Taq [[polimerasi]]'''<ref>{{Cita web|url=https://sciencing.com/role-taq-polymerase-pcr-7298417.html|titolo=The Role of Taq Polymerase in PCR|sito=Sciencing|lingua=en|accesso=2018-03-03}}</ref> o mediante altri enzimi come le '''[[transferasi]] terminali''' che permettono l’aggiunta di un singolo nucleotide all’estremità -3'. La corrispondente T è presente all’estremità -3’ dell’adattatore e ciò permette la formazione di due legami a idrogeno tra le due basi complementari e la conseguente ligazione.

[[File:Oligonucleotide chains in Flow Cell.png|miniatura|Una flow-cell con frammenti P5 e P7 in verde e rosa]]

*Amplificazione tramite PCR :La prima cosa da fare è arricchire (amplificare) perché il frammento di DNA può essere presente in una copia massimo due. Ovviamente è un po’ poco anche se il trend è quello di andare verso il single cell analysis.La cosa importante è che gli inserti si possano legare sulla slide ovvero la piastra (noisi parliamoparla di Illumina che è quello più famoso e maggiormente descritto). Sulla piastra gli oligo vengono sintetizzati con la tecnologia dei microarray. Per l'ibridazione è necessario che gli oligo presenti sulla piastra (flow-cell) si appaino con i frammenti da sequenziare. A tal fine esistono i frammenti '''P5''' e '''P7''' adesi alla flow-cell che sono complementari ai frammenti P5 e P7 presenti sui filamenti del DNA da sequenziare. (P5 e P7 sono le regioni che permetto di ancorare il nostro frammento alla slide e sono anche utilizzati come primer per l’amplificazione)

[[File:DNA Nanoball sequencing flow cell.jpg|miniatura|Ad ogni colore corrisponde una diversa base che viene aggiunta dalla DNA polimerasi.]]

:Dopo aver fatto avvenire l’ibridazione può iniziarelainiziare la reazione di PCR. Al termine della PCR dove c’era un frammento ibridato ora ce ne sono milioni. Questo processo prende il nome di '''Cluster Amplification'''. Il cluster al suo interno avrà l’inserto specifico e all’interno di un cluster la sequenza interna sarà la stessa, o meglio ci saranno le due sequenze complementari dell’inserto. Quindi alla fine della PCR arriviamosi arriva ad avere dei cluster e da una copia del DNA di partenza ottengosi ottengono molteplici copie. Questa è l’amplificazione, per ora non è stato sequenziato ancora niente ma è stato preparato il materiale da sequenziare.[[File:Oligonucleotide chains in Flow Cell.png|miniatura|Una flow-cell con frammenti P5 e P7 in verde e rosa]]'''SEQUENZIAMENTO'''

*Sequenziamento: Il cluster appena formato serve per avere milioni di sequenze vicine e identiche posizionate sulla flow-cell. A questo punto si utilizzano due primers che sono '''Rd1 SP''' e '''Rd2 SP''' (SP= ''sequencing primer'') i quali permetteranno alla DNA polimerasi di procedere con la sintesi di nucleotidi. Ad ogni nucleotide aggiunto corrisponde una particolare emissione di fluorescenza, un detector registra la fluorescenza emessa in ogni punto della flow-cell, e un sistema di output fornisce la sequenza esatta dei nucleotidi. [[File:DNA Nanoball sequencing flow cell.jpg|miniatura|Ad ogni colore corrisponde una diversa base che viene aggiunta dalla DNA polimerasi.]]

Il cluster appena formato serve per avere milioni di sequenze vicine e identiche posizionate sulla flow-cell. A questo punto si utilizzano due primers che sono '''Rd1 SP''' e '''Rd2 SP''' (SP= ''sequencing primer'') i quali permetteranno alla DNA polimerasi di procedere con la sintesi di nucleotidi. Ad ogni nucleotide aggiunto corrisponde una particolare emissione di fluorescenza, un detector registra la fluorescenza emessa in ogni punto della flow-cell, e un sistema di output fornisce la sequenza esatta dei nucleotidi. [[File:DNA Nanoball sequencing flow cell.jpg|miniatura|Ad ogni colore corrisponde una diversa base che viene aggiunta dalla DNA polimerasi.]]

== Note ==

<references />