Next Generation Sequencing: differenze tra le versioni

Versione delle 18:54, 3 mar 2018

Versione delle 18:55, 3 mar 2018

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* Estrazione del DNA: Il primo step è estrarre gli acidi nucleici dal materiale di partenza (vettore o genoma da cellula). A tal fine esistono in commercio dei kit.

* Frammentazione: Dopo l’estrazione degli acidi nucleici avviene la frammentazione o taglio del DNA, esistono tre metodi differenti di frammentazione:

**#Frammentazione fisica basata sull'utilizzo di ultrasuoni

**#Frammentazione enzimatica basata sull’utilizzo di trasposasi ingegnerizzate

**# Nebulizzazione: in questo caso Il DNA viene fatto passare attraverso piccoli fori applicando un’alta pressione

* End repair: I frammenti ottenuti possono avere le estremità overhangs al -5’ e al -3’ che vanno modificate in delle estremità blunt. Per fare questo si possono adottare due strategie:

**# ''DNA polimerasi I'': dal momento che è dotata di attività esonucleasica 3’-5’, i frammenti di DNA con l’estremità 5’ overhang possono essere smussati aggiungendo un dNTP al -3’ e le sporgenze al -3’ possono essere rimosse per attività esonucleasica 3' --> 5';

**# ''Mung Bean Nuclease'': i nucleotidi terminali non appaiati ad una estremità di DNA possono essere rimossi da questo singolo enzima specifico dotato di attività esonucleasica che idrolizza un legame fosfodiestere terminale, eliminando così la base “in eccesso” una alla volta.

*Selezione dei frammenti secondo le dimensioni: In questa fase è necessario separare i frammenti in base alla loro dimensione: la tecnologia Illumina permette di sequenziare fino a 500 bp per singola corsa per questo motivo sono ideali frammenti di DNA con dimensione comprese tra 350-500 bp Per ottenere frammenti della dimensione corretta si utilizzano dei kit commerciali.

:I frammenti vengono messi in un buffer con un rapporto differente di Sample Purification Beads SPB e PEG che ne permette la separazione. I primi ad essere rimossi sono i frammenti più lunghi e poi quelli più corti che vengono lavati via. Per separare questi frammenti si utilizzano [https://www.sepmag.eu/blog/magnetic-dna-purification-history-recent-developments magnetic beads]<ref>{{Cita news|lingua=en-us|nome=Lluis|cognome=Martinez|url=https://www.sepmag.eu/blog/magnetic-dna-purification-history-recent-developments|titolo=Magnetic DNA Purification: History and recent developments|accesso=2018-03-03}}</ref>.

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[[File:DNA Nanoball sequencing flow cell.jpg|miniatura|Ad ogni colore corrisponde una diversa base che viene aggiunta dalla DNA polimerasi.]]

:Dopo aver fatto avvenire l’ibridazione può iniziare la reazione di PCR. Al termine della PCR dove c’era un frammento ibridato ora ce ne sono milioni. Questo processo prende il nome di ''Cluster Amplification''. Il cluster al suo interno avrà l’inserto specifico e all’interno di un cluster la sequenza interna sarà la stessa, o meglio ci saranno le due sequenze complementari dell’inserto. Quindi alla fine della PCR si arriva ad avere dei cluster e da una copia del DNA di partenza si ottengono molteplici copie. Questa è l’amplificazione, per ora non è stato sequenziato ancora niente ma è stato preparato il materiale da sequenziare.

*Sequenziamento: Il cluster appena formato serve per avere milioni di sequenze vicine e identiche posizionate sulla flow-cell. A questo punto si utilizzano due primers che sono Rd1 SP e Rd2 SP (SP= ''sequencing primer'') i quali permetteranno alla DNA polimerasi di procedere con la sintesi di nucleotidi. Ad ogni nucleotide aggiunto corrisponde una particolare emissione di fluorescenza, un detector registra la fluorescenza emessa in ogni punto della flow-cell, e un sistema di output fornisce la sequenza esatta dei nucleotidi.

== Note ==