Next Generation Sequencing: differenze tra le versioni

Versione delle 18:55, 3 mar 2018

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*# ''DNA polimerasi I'': dal momento che è dotata di attività esonucleasica 3’-5’, i frammenti di DNA con l’estremità 5’ overhang possono essere smussati aggiungendo un dNTP al -3’ e le sporgenze al -3’ possono essere rimosse per attività esonucleasica 3' --> 5';

*# ''Mung Bean Nuclease'': i nucleotidi terminali non appaiati ad una estremità di DNA possono essere rimossi da questo singolo enzima specifico dotato di attività esonucleasica che idrolizza un legame fosfodiestere terminale, eliminando così la base “in eccesso” una alla volta.

*Selezione dei frammenti secondo le dimensioni: In questa fase è necessario separare i frammenti in base alla loro dimensione:. laLa tecnologia Illumina permette di sequenziare fino a 500 bp per singola corsa per questo motivo sono ideali frammenti di DNA con dimensione comprese tra 350-500 bp. Per ottenere frammenti della dimensione corretta si utilizzano dei kit commerciali.

:I frammenti vengono messi in un buffer con un rapporto differente di Sample Purification Beads SPB e PEG che ne permette la separazione. I primi ad essere rimossi sono i frammenti più lunghi e poi quelli più corti che vengono lavati via. Per separare questi frammenti si utilizzano ''magnetic beads''<ref>{{Cita news|lingua=en-us|nome=Lluis|cognome=Martinez|url=https://www.sepmag.eu/blog/magnetic-dna-purification-history-recent-developments|titolo=Magnetic DNA Purification: History and recent developments|accesso=2018-03-03}}</ref>.

*A-tailing: Viene adenilata l’estremità -3’ mediante l’addizione di una singola A. Questo può essere fatto mediante l’utilizzo di una Taq [[polimerasi]]<ref>{{Cita web|url=https://sciencing.com/role-taq-polymerase-pcr-7298417.html|titolo=The Role of Taq Polymerase in PCR|sito=Sciencing|lingua=en|accesso=2018-03-03}}</ref> o mediante altri enzimi come le [[transferasi]] terminali che permettono l’aggiunta di un singolo nucleotide all’estremità -3'. La corrispondente T è presente all’estremità -3’ dell’adattatore e ciò permette la formazione di due legami a idrogeno tra le due basi complementari e la conseguente ligazione.

[[File:Oligonucleotide chains in Flow Cell.png|miniatura|Una flow-cell con frammenti P5 e P7 in verde e rosa]]

*Amplificazione tramite PCR : La prima cosa da fare è arricchire (amplificare) perché il frammento di DNA può essere presente in una copia massimo due. Ovviamente è un po’ poco anche se il trend è quello di andare verso il single cell analysis.La cosa importante è che gli inserti si possano legare sulla slide ovvero la piastra (si parla di Illumina che è quello più famoso e maggiormente descritto). Sulla piastra gli oligo vengono sintetizzati con la tecnologia dei microarray. Per l'ibridazione è necessario che gli oligo presenti sulla piastra (flow-cell) si appaino con i frammenti da sequenziare. A tal fine esistono i frammenti P5 e P7 adesi alla flow-cell che sono complementari ai frammenti P5 e P7 presenti sui filamenti del DNA da sequenziare. (P5 e P7 sono le regioni che permettono di ancorare il frammento alla slide e sono anche utilizzati come primer per l’amplificazione)

[[File:DNA Nanoball sequencing flow cell.jpg|miniatura|Ad ogni colore corrisponde una diversa base che viene aggiunta dalla DNA polimerasi.]]

:Dopo aver fatto avvenire l’ibridazione può iniziare la reazione di PCR. Al termine della PCR dove c’era un frammento ibridato ora ce ne sono milioni. Questo processo prende il nome di ''Cluster Amplification''. Il cluster al suo interno avrà l’inserto specifico e all’interno di un cluster la sequenza interna sarà la stessa, o meglio ci saranno le due sequenze complementari dell’inserto. Quindi alla fine della PCR si arriva ad avere dei cluster e da una copia del DNA di partenza si ottengono molteplici copie. Questa è l’amplificazione,; in perquesta orafase non è stato sequenziato ancora niente ma è stato preparato il materiale da sequenziare.

*Sequenziamento: Il cluster appena formato serve per avere milioni di sequenze vicine e identiche posizionate sulla flow-cell. A questo punto si utilizzano due primers che sono Rd1 SP e Rd2 SP (SP= ''sequencing primer'') i quali permetteranno alla DNA polimerasi di procedere con la sintesi di nucleotidi. Ad ogni nucleotide aggiunto corrisponde una particolare emissione di fluorescenza, un detectorrilevatore registra la fluorescenza emessa in ogni punto della flow-cell, e un sistema di outputuscita fornisce la sequenza esatta dei nucleotidi.

== Note ==