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* la progettazione di [[Primer|inneschi]];
* l'ottimizzazione degli stati di reazione.
Per alcuni geni bersaglio, le impostazioni degli inneschi e le condizioni ottimizzate sono state raccolte in alcune banche dati<ref>{{Cita web|url=http://www.realtimeprimers.org/|titolo=Real Time PCR Primer Sets|accesso=2 maggio 2019|dataarchivio=23 aprile 2015|urlarchivio=https://web.archive.org/web/20150423102430/http://www.realtimeprimers.org/|titolourlmorto=Real Time PCR Primer Setssì}}</ref> per facilitare lo sviluppo delle analisi. In una reazione tipica, il prodotto di PCR si raddoppia ad ogni ciclo dell'amplificazione. Siccome sono necessari parecchi cicli affinché abbastanza prodotto sia rilevabile, il diagramma della fluorescenza sul numero dei cicli esibisce un andamento sigmoide. Nei cicli finali, i substrati di reazione iniziano a scarseggiare, i prodotti di PCR non raddoppiano e la curva comincia ad appiattirsi. Il punto sulla curva in cui la quantità di fluorescenza comincia ad aumentare velocemente, solitamente alcuni scarti quadratici medi sopra la linea di base, è chiamato il ciclo soglia (valore di Ct). Il diagramma di Ct su DNA stampo è lineare, così un confronto dei valori di Ct fra reazioni multiple permette di calcolare la concentrazione dell'acido nucleico che si vuole quantificare. La [[Coefficiente angolare|pendenza]] di questa linea fornisce inoltre una misura dell'efficienza della PCR. Alcuni strumenti permettono agli utenti di generare delle curve di [[denaturazione del DNA|melting]] che seguono il completamento della PCR. Le curve di melting forniscono un'indicazione della purezza del prodotto di reazione e rivelano la presenza di [[Dimero|dimeri]] degli inneschi.
