Western blot: differenze tra le versioni

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=== Elettroforesi su gel ===

{{Vedi anche|Elettroforesi su gel}}

Le proteine del campione sono separate usando l'elettroforesi in gel. La separazione di proteine può avvenire per [[punto isoelettrico]] (pI), [[peso molecolare]], carica elettrica, o una combinazione di questi fattori. La natura della separazione dipende dal trattamento del campione e dalla natura del gel. Questo modo è il più usato per identificare una proteina. Il tipo più comune di elettroforesi in gel impiega [[gel di poliacrilammide]] ([[Elettroforesi su gel di poliacrilammide]]) e tamponi caricati con [[laurilsolfato di sodio]] (SDS). La [[SDS-PAGE]] (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) mantiene polipeptidi in uno stato denaturato una volta trattato con agenti riducenti forti per rimuovere strutture secondarie e terziarie (esempio disolfuro [S-S] e gruppi [[mercaptani]] [SH e SH]) e permettere la separazione di proteine in base al loro [[peso molecolare]]. Le proteine campionate legano il SDS che conferisce loro carica negativa e si muovono in questo modo verso l'elettrodo positivo attraverso le ''mesh''rete di pori del gel. Le proteine più piccole migrano più velocemente attraverso questa ''mesh''rete e le proteine vengono separate in base alla dimensione (misurata in [[Unità di massa atomica|kiloDalton]], kDa). La concentrazione di acrilammide determina la risoluzione del gel - maggiore la concentrazione, migliore la risoluzione di proteine a basso peso molecolare. Le proteine viaggiano solo in una dimensione lungo il gel per diversi blot. I campioni sono caricati in ''wells'' (pozzetti) nel gel. Una striscia è usualmente riservata per un ''marcatore'' o ''scala'', una miscela commerciale di proteine con peso molecolare definito, tipicamente colorate così da formare bande colorate visibili. Quando la [[tensione elettrica]] è applicata lungo il gel, le proteine migrano attraverso esso a velocità differenti, in funzione della loro dimensione. Queste differenti velocità di avanzamento (''[[elettroforesi|mobilità elettroforetica]]'') permettono la separazione in ''bande'' dentro ciascuna ''corsia''.

[[File:SDS-PAGE Electrophoresis.png|center]]

È inoltre possibile usare l'[[elettroforesi bidimensionale]].

=== TransferTransferimento ===

Per rendere accessibili le proteine alla rilevazione dell'anticorpo esse vengono trasferite dal gel ad una membrana di ''[[Nitrocellulosa]] o [[Polivinilidenfluoruro]] ([[PVDF]]''). Il metodo principale per il trasferimento è chiamato "[[electroblotting]]" e usa [[corrente elettrica]] per trasferire le proteine dal gel alla membrana. Le proteine si muovono dal gel alla membrana mentre mantengono l'organizzazione presente nel gel. Un metodo più vecchio di trasferimento consiste nel mettere una membrana sul gel e strati di carta filtrante al di sopra di essa. Il tutto è posto in una soluzione tampone che si muove verso l'alto del filtro per [[capillarità]], portando le proteine con sé. Quest'ultimo metodo non è usato perché richiede troppo tempo. L'[[electroblotting]] è preferito. Come risultato di entrambi i processi di "blotting", le proteine sono esposte su una superficie sottile per la rilevazione (vedi sotto). Membrane diverse sono scelte per le loro proprietà non-specifica di legame con proteine diverse. Il legame alla proteina è basato sulle interazioni [[idrofobia|idrofobiche]], così come le interazioni tra la membrana e la proteina. Le membrane di [[nitrocellulosa]] sono più economiche di quelle in [[PVDF]], ma molto più fragili e non facilmente riutilizzabili.

[[File:Western blot transfer.png|center]]

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=== Bloccaggio ===

Dopo aver scelto la membrana per la capacità di legare la proteina, è necessario prevenire le interazioni tra la membrana e l'anticorpo usato per rilevare la proteina bersaglio. Il bloccaggio di legami non specifici è raggiunto ponendo la membrana in una soluzione diluita di proteina - tipicamente 3-5% [[Bovinealbumina serumsierica albuminbovina]] (BSA) o [[latte in polvere]] in [[Tampone tris salino|tampone Tris-Buffered Salinesalino]] (TBS), con una piccola percentuale di detergente come [[Tween 20]] o [[Triton X-100]]. La proteina nella soluzione diluita attecchisce alla membrana in tutti i punti dove le proteine bersaglio non hanno attecchito. Questo permette, quando l'anticorpo è aggiunto, che esso non si leghi a siti aspecifici in quanto già occupati dalla proteina precedentemente citata. Questo riduce il "[[rumore]]" nel prodotto finale, portando risultati più puliti, e eliminando falsi positivi.

=== Rilevamento ===

Durante il processo di rilevamento la membrana diventa il provino per la proteina d'interesse con un anticorpo modificato che è collegato a un [[enzima]] messaggero; quando esposto ad un appropriato substrato questo enzima crea una reazione colorimetrica e produce un [[colore]]. Per una serie di ragioni questo processo si svolge, tradizionalmente, in due fasi ("two-step"), anche se esistono metodi per processi a singola fase ("one-step") per determinate applicazioni.

==== Two-stepDue fasi ====

* Anticorpo primario

Gli anticorpi primari sono generati quando la specie ospite o le colture di [[cellule]] immunitarie sono esposti alla [[proteina]] di interesse (o parte ad essa vicina). Normalmente questo è parte della risposta immunitaria, dove essi sono coltivati e usati come dispositivi specifici di rilevamento che legano la proteina direttamente. Dopo il ''blocking''bloccaggio, una soluzione diluita di anticorpo primario (generalmente tra 0.5 e 5 µg/ml) è incubato con la membrana agitandolo delicatamente. Tipicamente, la soluzione è composta da una soluzione tampone con una piccola percentuale di detergente, e qualche volta con [[latte in polvere]] o [[Bovine serum albumin|BSA]]. La soluzione anticorpo e la membrana possono essere sigillate e incubate assieme per 30 minuti o una notte intera. Può inoltre essere incubata a differenti temperature (a temperature più calde si associano legami più forti) sia sulla specifica [[proteina]] (target, il "segnale") e non-specifica ("[[rumore]]").

* Anticorpo secondario

Dopo il risciacquo della membrana per rimuovere l'anticorpo primario non legato, alla membrana è associato un altro anticorpo, diretto a una specifica specie di anticorpo primario. Anticorpi provengono da animali (o colture ibride di provenienza animale, [[ibridoma|ibridomi]]), un anticorpo secondario del topo si legherà a qualsiasi anticorpo primario di topo, permettendo risparmi sui costi, consentendo a un intero laboratorio di condividere un'unica fonte di anticorpo prodotto, e fornisce risultati migliori. Questo è conosciuto come anticorpo secondario, e data le sue proprietà bersaglio, ci si riferisce a "anti-topo," "anti-capra," ecc. L'anticorpo secondario è legato solitamente alla [[biotina]] o all'[[enzima]] messaggero come [[fosfatasi|fosfatasi alcalina]] o [[Armoracia rusticana|perossidasi Armoracia rusticana]]. Questo significa che diversi anticorpi secondari si legheranno a un anticorpo primario, aumentando il segnale. Comunemente, un legame-[[Armoracia rusticana|perossidasi Armoracia rusticana]] secondario è usato per dividere un agente [[chemiluminescenza|chemiluminescente]], e la reazione prodotta emette [[luminescenza]] proporzionale all'ammontare di proteina. Una [[pellicola fotografica]] è posta contro la membrana; esposta alla luce della reazione crea un'immagine di anticorpi legato al blot. Un sistema più economico utilizza un colorante 4-cloronaftolo all'1% di [[perossido di idrogeno]]; la reazione di radicali perossido con il 4-cloronaftolo produce colore porpora scuro, permettendo la [[fotografia]] senza l'utilizzo di [[Pellicola fotografica|pellicole]] specifiche.

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Una terza alternativa è usare etichette radioattive piuttosto che un enzima accoppiato all'anticorpo secondario, così come etichettare una proteina anticorpo non-legante come la proteina A di ''[[Staphylococcus]]'' o [[Streptavidina]] con un [[isotopo radioattivo]] di [[Iodio]]. Dato che altri metodi sono più sicuri, veloci, economici, questo è ora il meno usato; il vantaggio di questo metodo è la sensibilità radiografica che permette quantificazioni di proteina molto accurate, quando associato a software specifici (esempio l'Optiquant).

==== One-stepSingola fase ====

Storicamente il processo di campionamento fu fatto in due passi data la relativa semplicità di produrre anticorpi primari e secondari in processi separati. Questo dà ai ricercatori molti vantaggi in termini di flessibilità, e aggiunge una amplificazione nel rilevamento. Dato l'avvento di analisi proteiche ad alta efficienza e limiti più bassi di rilevamento, c'è stato interesse a sviluppare sistemi ''one-step''a singola fase che permettono maggior velocità di esecuzione e meno consumabili. Questo richiede un provino anticorpo che rileva la proteina d'interesse e che contenga un'etichetta rilevabile, provini che spesso sono disponibili per [[proteina bersaglio]]. Il provino primario è incubato con la membrana in un modo simile a quello dell'anticorpo primario in un processo two-stepa due fasi, e così è pronto per il rilevamento diretto dopo una serie di lavaggi.

=== Analisi ===

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==== Rilevazione colorimetrica ====

La rilevazione colorimetrica dipende dall'incubazione del western blot con un substrato che reagisce con l'[[enzima]] ''reporter''convertitore (come [[perossidasi]]) legato all'anticorpo secondario. Questo converte il colorante solubile in forma insolubile di differenti che precipitano in prossimità dell'enzima e conseguentemente colora la membrana. Lo sviluppo del ''blot'' è fermato dal lavaggio dei coloranti. I livelli di proteina sono valutati con [[densitometria]] (maggiore ove più colorato) o [[spettrofotometria]].

==== Rilevazione con chemiluminescenza ====

I metodi con rilevazione [[Chemiluminescenza|chemiluminescente]] dipendono dall'incubazione del western blot con un substrato che emette luce quando esposto al ''reporter''convertitore dell'anticorpo secondario. La luce è rilevata da pellicola fotografica, e più recentemente da [[Dispositivo a carica accoppiata|sensori CCD]] che catturano un'immagine digitale del western blot. L'immagine analizzata con [[densitometria]] rileva l'ammontare di proteina colorante e quantifica i risultati in termini di densità ottica. Nuovi software permettono ulteriori analisi come il [[peso molecolare]].

[[File:Western blot chemiluminescent detection.png|center]]

==== Rilevazione radioattiva ====

''Label''I radioattivemarcatori radioattivi non richiedono substrati enzimatici, permettendo il posizionamento di pellicole a [[raggi X]] direttamente contro il western blot che sviluppa, con l'esposizione, zone scure corrispondenti alla proteina d'interesse. È una tecnica dispendiosa e pericolosa, meglio preferire l'alternativa ECL (enhanced chemiluminescence).

[[File:Blotautoradiogram.png|frame|Western blot con sistema a rilevamento radioattivo]]

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=== Prova secondaria ===

La maggior differenza tra membrane di [[nitrocellulosa]] e [[PVDF]] è la capacità di supportare lo ''stripping'l'eliminazione di anticorpi per il riutilizzo della membrana con provini successivi. Mentre ci sono protocolli ben definiti per membrane in nitrocellulosa, quelle in PVDF permettono riutilizzi numerosi prima di perdere sensibilità. Un'altra differenza è che, diversamente dalla nitrocellulosa, PVDF deve essere tenuto in soluzione al 95% di [[etanolo]], [[isopropanolo]] o [[metanolo]], prima dell'uso. Membrane PVDF tendono ad essere più sottili e robuste nell'uso.

== Elettroforesi 2D ==