Western blot: differenze tra le versioni

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[[File:Anti-lipoic acid immunoblot.png|thumb|Western blot usando un anticorpo che rileva proteine modificate con [[acido lipoico]]]]

Il '''western blot''' o '''immunoblot''' è una tecnica [[biochimica]] che permette di identificare una determinata [[proteina]] in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di [[anticorpi]] specifici;<ref name=":1">{{Cita pubblicazione|cognome1=Yang|nome1=Ping-Chang|cognome2=Mahmood|nome2=Tahrin|data=2012|titolo=Western blot: Technique, theory, and trouble shooting|url= |rivista=North American Journal of Medical Sciences|volume=4|numero=9|pp=429–434429-434|doi=10.4103/1947-2714.100998|pmid=23050259|issn=1947-2714|pmc=3456489}}</ref> in generale, per facilitare il riconoscimento, la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni (o [[peso molecolare]]) utilizzando un gel di [[poliacrilammide]] (ma esistono variazioni quali il [[dot blot]] o slot blot, in cui la miscela proteica non viene separata in base alle dimensioni, ma ci si affida alla selettività antigene/anticorpo); successivamente le proteine vengono trasferite su un supporto, che comunemente è una membrana di [[nitrocellulosa]], e quindi si procede al riconoscimento vero e proprio della proteina mediante l'utilizzo di un anticorpo specifico.

Recentemente sono state messe a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, evitando quindi il trasferimento su membrana. Questa tecnica si usa quando il campione è composto da una miscela di moltissime proteine tali che con una colorazione standard ([[blu di Kumasi|blu di Coomassie]] o [[nitrato di argento]]) non si riuscirebbe a distinguerle l'una dall'altra, oppure quando, pur avendo bande ben distinte ('''discrete'''), la proteina di interesse è in quantità troppo basse per essere visualizzata con altre tecniche. Infatti il western possiede tre passaggi in cui avviene l'amplificazione del segnale, ciò rende visibili anche decimi di picomole (10⁻¹²mol) di proteina.<ref name="Towbin1979">{{Cita pubblicazione|autore=Towbin H, Staehelin T, Gordon J.|anno=1979|titolo=Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications|url=https://archive.org/details/sim_proceedings-of-the-national-academy-of-sciences-usa_1979-09_76_9/page/4350|rivista=Proceedings of the National Academy of Sciences USA|volume=76|numero=9|doi=10.1073/pnas.76.9.4350|pp=4350–544350-54|pmid=388439|pmc=411572}}</ref><ref name="Renart1979">{{Cita pubblicazione|autore=Renart J, Reiser J, Stark GR.|anno=1979|titolo=Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure|url=https://archive.org/details/sim_proceedings-of-the-national-academy-of-sciences-usa_1979-07_76_7/page/3116|rivista=Proceedings of the National Academy of Sciences USA|volume=76|numero=7|doi=10.1073/pnas.76.7.3116|pp=3116–203116-20|pmid=91164|pmc=383774}}</ref><ref name="urlExactantigen">{{Cita web|url=http://www.exactantigen.com/review/western-blot-antibody.html|titolo=Western blot antibody|accesso=29 gennaio 2009|urlarchivio=https://web.archive.org/web/20091217064033/http://www.exactantigen.com/review/western-blot-antibody.html|urlmorto=sì}}</ref>

== Storia ==

Il metodo è stato ideato da [[George Stark]] alla [[Stanford University]]. Il nome ''Western blot'' fu dato dalla tecnica di [[W. Neal Burnette]],<ref name="Burnette1981">{{Cita pubblicazione|autore=Burnette WN.|anno=1981|titolo='Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A|rivista=Analytical Biochemistry|volume=112|numero=2|doi=10.1016/0003-2697(81)90281-5|pp=195–203195-203|issn=0003-2697|pmid=6266278}}</ref> è un gioco sul nome [[Southern blot]], tecnica per il rilevamento di [[DNA]] sviluppato precedentemente da [[Edwin Southern]]. Il rilevamento di [[RNA]] è chiamato [[Northern blot]].<ref name=Stark1977>{{Cita pubblicazione|autore=Alwine J, Kemp D, Stark G |titolo=Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes |url=https://archive.org/details/sim_proceedings-of-the-national-academy-of-sciences-usa_1977-12_74_12/page/5350 |rivista=Proceedings of the National Academy of Sciences USA |volume=74 |numero=12 |pp=5350–53545350-5354 |anno=1977 |pmid=414220 |doi=10.1073/pnas.74.12.5350 |pmc=431715|bibcode=1977PNAS...74.5350A }}</ref>

Ci sono molte aziende di reagenti specifici per anticorpi ([[anticorpo monoclonale|monoclonali]] e [[anticorpo policlonale|policlonali]]) contro decine di migliaia di proteine differenti.<ref name="urlExactantigen"/> Gli anticorpi commerciali possono essere costosi, quelli non legati possono essere riutilizzati. Questo metodo è usato in [[biologia molecolare]], [[biochimica]], [[immunogenetica]] e altre discipline.

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Per rendere accessibili le proteine alla rilevazione dell'anticorpo esse vengono trasferite dal gel ad una membrana di ''[[Nitrocellulosa]] o [[Polivinilidenfluoruro]] ([[PVDF]]''). Il metodo principale per il trasferimento è chiamato "[[electroblotting]]" e usa [[corrente elettrica]] per trasferire le proteine dal gel alla membrana. Le proteine si muovono dal gel alla membrana mentre mantengono l'organizzazione presente nel gel. Un metodo più vecchio di trasferimento consiste nel mettere una membrana sul gel e strati di carta filtrante al di sopra di essa. Il tutto è posto in una soluzione tampone che si muove verso l'alto del filtro per [[capillarità]], portando le proteine con sé. Quest'ultimo metodo non è usato perché richiede troppo tempo. L'[[electroblotting]] è preferito. Come risultato di entrambi i processi di "blotting", le proteine sono esposte su una superficie sottile per la rilevazione (vedi sotto). Membrane diverse sono scelte per le loro proprietà non-specifica di legame con proteine diverse. Il legame alla proteina è basato sulle interazioni [[idrofobia|idrofobiche]], così come le interazioni tra la membrana e la proteina. Le membrane di [[nitrocellulosa]] sono più economiche di quelle in [[PVDF]], ma molto più fragili e non facilmente riutilizzabili.

[[File:Western blot transfer.png|center]]

L'uniformità e l'effettivo trasferimento di proteina dal gel alla membrana può essere controllata colorando la membrana con [[Blu di Kumasi|Blu di Coomassie]] o con [[Ponceau S]] è il più comune dei due, data l'alta sensibilità e solubilità in acqua, più facilmente decolorabile per analizzare la membrana, come descritto sotto.<ref name="Corley2005">{{Cita libro|autore=Corley RB.|titolo=A Guide to Methods in the Biomedical Sciences|url=http://books.google.com/books?id=cyk3ggr_y90C&pg=PA11|anno=2005|editore=Springer|isbn=978-0-387-22844-0|ppp=11}}</ref>

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