Microarray di DNA: differenze tra le versioni
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Sui microarray a bassa densità solitamente si usavano marcatori radioattivi, questo tipo di marcatori però non permettono una risoluzione sufficientemente elevata per i chip ad alta densità, con i quali è necessario utilizzare marcatori fluorescenti.
Una volta che il microarray è stato costruito o comprato e il campione di acidi nucleici da analizzare è stato isolato si fa avvenire la reazione di ibridazione, che permette la formazione degli eteroduplex. Per ottenere dei buoni microarray è essenziale difenderli dall'umidità (se l'ambiente è secco la soluzione evapora, se invece è umido si deposita dell'acqua) e dalla polvere (ogni spot è grande circa 50 micron, un granello di polvere e più grande di 50 micron, per cui può coprire vari spot), per questo motivo esistono delle camere apposite per l'ibridazione dei microarray che vengono sigillate. Dopo l'ibridazione il microarray viene lavato per rimuovere il cDNA che non si è legato.
Generalmente il Dna fluorescente dei campioni sperimentali è mescolato con un Dna di un soggetto di controllo marcato con un colorante fluorescente diverso. Per i microarray si usano solitamente Cy3 (che emette una lunghezza d'onda nel campo del verde) e Cy5 (che emette nel campo del rosso). In questo modo se la quantità di RNA espressa da un gene nelle cellule di interesse è aumentata (up regolata) rispetto a quella del campione di riferimento, lo spot che ne risulta sarà del colore del primo fluorescente. Viceversa se l'espressione del gene è diminuita (down regolata) rispetto al campione di riferimento lo spot sarà colorato dal secondo fluorescente.
La fluorescenza è rilevata poi grazie ad uno scanner a laser, grazie al quale si acquisisce un'immagine per ogni fluoroforo. Poi vengono usati dei software appositi per convertire i segnali in una gamma di colori dipendente dalla loro intensità. Il segnale rilevato dallo scanner viene poi sottoposto ad altri algoritmi di filtrazione e di pulizia e convertito in valori numerici.
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