Complesso di pre-replicazione: differenze tra le versioni

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Il '''complesso di pre-replicazione''' (in inglese ''pre-Replication Complex'', o ''pre-RC'') è un complesso multiproteico che nelle [[cellule]] [[eucariote]] si assembla sulle [[origine di replicazione|origini di replicazione]] del [[DNA]] il cui ruolo è quello di iniziare la [[replicazione del DNA]].

L'assemblaggio del complesso sulle origini di replicazione avviene durante la [[fase M]] tardiva e prosegue nella [[fase G1]] precoce del [[ciclo cellulare]], quando i livelli delle [[cicline]] sono bassi. Il livello basso di cicline consente infatti la formazione del ''pre-RC'' ma non ne permette l'attivazione, che richiede invece alti livelli di cicline E ed A:<ref name=woodfine>{{cita pubblicazione|autore=Woodfine K, Fiegler H, Beare DM, Collins JE, McCann OT, Young BD, Debernardi S, Mott R, Dunham I, Carter NP.|titolo=Replication timing of the human genome|rivista=Hum. Mol. Genet.|anno=2004|volume=13|numero=2|paginepp=191-202|pmid=14645202|

url=http://hmg.oxfordjournals.org/content/13/2/191.full.pdf|accesso=7 luglio 2013}}</ref> questo è uno dei più importanti meccanismi che impedisce la doppia replicazione di una stessa regione di DNA all'interno di un solo ciclo. La regolazione dell'assemblaggio del ''pre-RC'' è dunque il processo fondamentale che fa sì che durante la replicazione cellulare non vengano lasciate regioni di DNA non replicate o che altre regioni vengano replicate più di una volta.<ref name=bell>{{cita pubblicazione|autore=Bell SP, Dutta A. |titolo=DNA replication in eukaryotic cells|rivista=Annu. Rev. Biochem.|anno=2002|numero=71|paginepp=333-374|pmid=12045100}}</ref><ref name=nishitani>{{cita pubblicazione|autore=Nishitani H, Lygerou Z.|titolo=Control of DNA replication licensing in a cell cycle|rivista=Genes Cells|anno=2002|numero=6|volume=7|paginepp=523-534|pmid=12059957|url=http://onlinelibrary.wiley.com/store/10.1046/j.1365-2443.2002.00544.x/asset/j.1365-2443.2002.00544.x.pdf?v=1&t=hivyt8gr&s=ea1288646e4a05b9f0841e9d5995612720e082bc|accesso=7 luglio 2013}}</ref>

==Assemblaggio del complesso==

Il primo evento che caratterizza l'assemblaggio del ''pre-RC'' è il legame con il potenziale sito di origine del [[Origin Recognition Complex|complesso di riconoscimento dell’origine]] (''Origin Recognition Complex'', ''ORC''). ORC agisce come impalcatura sulla quale vengono reclutate le proteine Cdc6 e Cdt1, che a loro volta mediano il caricamento sul DNA della [[elicasi]] MCM2-7<ref name=bell/><ref name=nishitani/>. Cdc6 si lega ad ORC insieme ad [[Adenosina trifosfato|ATP]], quindi si lega Cdt1, il quale si associa stabilmente in un complesso con MCM2-7. L’[[idrolisi]] di ATP mediata da Cdc6 è accoppiata al rilascio di Cdt1 dal complesso e ad un cambiamento conformazione del complesso MCM2-7 che ne provoca una chiusura ad anello sul DNA. A questo punto, anche Cdc6 si dissocia dal complesso. Il complesso MCM2-7 agisce da elicasi per l’apertura della doppia elica di DNA e precede l’assemblaggio del macchinario di replicazione del DNA ([[replisoma]]) e dunque alla sintesi dei nuovi filamenti. Dopo questo evento l’origine di replicazione non è più in grado di tornare in stato di ''licensing'' fino ad una successiva fase G1, consentendo alla replicazione di iniziare da ogni origine una sola volta per ogni ciclo cellulare.<ref name=aparicio>{{cita pubblicazione|autore=Aparicio OM, Weinstein DM, Bell SP.|titolo=Components and dynamics of DNA replication complexes in S. cerevisiae: Redistribution of MCM proteins and Cdc45p during S phase|rivista=Cell.|anno=1997|volume=91|numero=1|paginepp=59-69|pmid=9335335}}</ref><ref name= ishimi>{{cita pubblicazione|autore=Ishimi Y.|titolo=A DNA helicase activity is associated with an MCM4, -6, and -7 protein complex|rivista=J Biol. Chem.|anno=1997|numero=1|volume=272|paginepp=24508-24513|pmid=9305914|url=http://www.jbc.org/content/272/39/24508.full.pdf|accesso=7 luglio 2013}}</ref>

==Componenti del complesso==

===ORC===

ORC è un complesso formato da sei [[subunità]] evolutivamente conservate in diverse specie<ref name=bell2>{{cita pubblicazione|autore=Bell SP.|titolo=The origin recognition complex: from simple origins to complex functions|rivista=Genes Dev.|anno=2002|volume=16|numero=6|paginepp=659-672|pmid=11914271|url=http://genesdev.cshlp.org/content/16/6/659.full.pdf|accesso=7 luglio 2013}}</ref> con attività ATPasica. In lievito ORC si trova legato alla cromatina per tutta la durata del ciclo cellulare mentre negli eucarioti superiori solo le subunità 2-6 rimangono sempre associate alla [[cromatina]]: la subunità 1 (ORC1), che si lega in fase G1 e recluta in sequenza i fattori di caricamento Cdc6 e Cdt1, viene rilasciata dalla [[cromatina]] a seguito della [[fosforilazione]] del complesso.<ref name=depamphilis>{{cita pubblicazione|autore=DePamphilis ML.|titolo=Cell cycle dependent regulation of the origin recognition complex|rivista=Cell Cycle.|anno=2005|numero=1|volume=4|paginepp=70–79|pmid=15611627|url=http://www.landesbioscience.com/journals/cc/depamphilisCC4-1.pdf|accesso 7 luglio 2013}}</ref> In ''[[Saccharomyces cerevisiae|S. cerevisiae]]'' sono state individuate delle sequenze specifiche di DNA in corrispondenza delle origini di replicazione che vengono riconosciute e legate dal complesso ORC. Al contrario, negli [[eucarioti]] superiori ORC sembra in grado di legare le origini senza che vi sia una sequenza specifica ad identificarle.

===Cdc6===

Cdc6 fu osservato inizialmente in ''S. cerevisiae'' come fattore necessario per l'ingresso in [[fase S]], è conservato negli eucarioti e codifica per una proteina con una significativa similarità con ORC1.<ref name=hartwell>{{cita pubblicazione|autore=Hartwell LH.|titolo=Sequential function of gene products relative to DNA synthesis in the yeast cell cycle|rivista=J Mol. Biol.|anno=1976|volume=104|numero=4|paginepp=803-817|pmid=785015}}</ref> È stato dimostrato che Cdc6 lega ORC ''[[in vitro]]'' e il suo [[dominio (biochimica)|dominio]] [[ATPasi|ATPasico]] è fondamentale per l'assemblaggio del ''pre-RC''. Cdc6 viene inattivato dopo il ''licensing'' mediante esportazione dal [[nucleo cellulare|nucleo]], tornando ad accumularsi nuovamente già in fase S.<ref name=mendez>{{cita pubblicazione|autore=Mendez J, Stillman B.|titolo=Chromatin association of human origin recognition complex, Cdc6, and minichromosome maintenance proteins during the cell cycle: Assembly of prereplication complexes in late mitosis|rivista=Mol. Cell. Biol.|anno=2000|numero=20|paginepp=8602–8612|pmid=11046155|url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC102165/pdf/mb008602.pdf|accesso 7 luglio 2013}}</ref>

===Cdt1===

Cdt1 fu scoperto in ''[[Schizosaccharomyces pombe|S. pombe]]''<ref name=hofmann>{{cita pubblicazione|autore=Hofmann JF, Beach D.|titolo=Cdt1 is an essential target of the Cdc10/Sct1 transcription factor: requirement for DNA replication and inhibition of mitosis|rivista=EMBO J.|anno=1994|volume=13|numero=2|paginepp=425-434|pmid=8313888|url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC394824/pdf/emboj00050-0157.pdf|accesso=7 luglio 2013}}</ref> come fattore necessario per la replicazione del DNA. In diversi organismi<ref name=maiorano>{{cita pubblicazione|autore=Maiorano D, Moreau J, Mechali M.|titolo=XCDT1 is required for the assembly of pre-replicative complexes in Xenopus laevis|rivista=EMBO J.|anno=1994|numero=13|paginepp=622- 625}}</ref><ref name=nishitani2>{{cita pubblicazione|autore=Nishitani H, Lygerou Z, Nishimoto T, Nurse P.|titolo=The Cdt1 protein is required to license DNA for replication in fission yeast|rivista=Nature|anno=2000|volume=404|numero=6778|pp=625- 628|pmid=10766247}}</ref> una sua iperespressione è in grado, da sola, di provocare ri-replicazione delle stesse origini di replicazione in un unico ciclo cellulare.<ref name=vaziri>{{cita pubblicazione|autore=Vaziri C, Saxena S, Jeon Y, Lee C, Murata K, Machida Y, Wagle N, Hwang DS, Dutta A.|titolo=A p53-dependent checkpoint pathway prevents rereplication|rivista=Mol. Cell.|anno=2003|volume=11|numero=4|paginepp=997-1008|pmid=12718885}}</ref> Cdt1 pare agire da collegamento tra il complesso ATPasico formato da ORC e Cdc6 ed il complesso elicasico MCM2-7. Nei metazoi Cdt1 viene inattivato in fase S<ref name=nishitani3>{{cita pubblicazione|autore=Nishitani H, Taraviras S, Lygerou Z, Nishimoto T.|titolo=The human licensing factor for DNA replication Cdt1 accumulates in G1 and is destabilized after initiation of S-phase|rivista=J. Biol. Chem.|anno=2001|volume=276|numero=48|paginepp=44905–44911|pmid=11555648|url=http://www.jbc.org/content/276/48/44905.full.pdf|accesso=7 luglio 2013}}</ref> attraverso tre diversi meccanismi: esporto dal nucleo, degradazione mediata da Ddb1-Cul4 o SCF-Skp2 oppure interazione con ''[[geminina]]''.

===MCM2-7===

Il complesso MCM2-7 ha una struttura ad anello formata da sei subunità con attività elicasica ATP-dipendente. Non è stato possibile finora osservare ''in vitro'' tale attività del complesso MCM2-7, mentre è nota attività elicasica dei subcomplessi MCM2/4/6 ''in vitro''.<ref name=takahashi>{{cita pubblicazione|autore=Takahashi TS, Wigley DB, Walter JC.|titolo=Pumps, paradoxes and ploughshares: Mechanism of the MCM2–7 DNA helicase|rivista=Trends Biochem. Sci.|anno=2005|volume=30|numero=8|paginepp=437–444|pmid=16002295}}</ref> Si è visto che il caricamento del complesso MCM2-7 è efficace solo se vi è un legame sequenziale di Cdc6 e Cdt1, unito all'attività ATPasica del complesso ORC-Cdc6. Cicli successivi di idrolisi di ATP da parte di ORC-Cdc6 portano al caricamento sul DNA di numerosi complessi MCM2-7: non è chiaro tuttavia il modo in cui essi vengano attivati per dare attività elicasica. Il complesso MCM2-7 non è stato individuato nel replisoma, è pertanto probabile che esso abbia la sola funzione di aprire la doppia elica di DNA e formare la [[bolla di replicazione]], per essere poi sostituito da un'elicasi più processiva per la successiva duplicazione.

==''Firing''==

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===Inibizione dell’assemblaggio del pre-RC mediata dalle CDK===

L’attivazione delle CDK a partire dalla fase S ha come effetto la fosforilazione di alcuni componenti del pre-RC, come ad esempio Cdc6, che viene così esportato dal nucleo per impedire il suo assemblaggio sull’origine. La fosforilazione da parte delle CDK è alla base di una via di degradazione proteolitica di Cdt1: Il complesso CiclinaA/CDK2 fosforila Cdt1 sulla [[tirosina]] 29. L’[[ubiquitina ligasi]] SCF, attraverso la proteina adattatrice Skp2 (che è in grado di legarsi esclusivamente a substrati fosforilati) [[ubiquitina]] Cdt1, che viene in seguito degradato nel [[proteasoma]] durante la fase S.<ref name=tada>{{cita pubblicazione|autore=Tada S, Li A, Maiorano D, Mechali M, Blow JJ.|titolo=Repression of origin assembly in metaphase depends on inhibition of RLF-B/Cdt1 by geminin|rivista=Nat Cell Biol|anno=2001|numero=2|volume=3|paginepp=107-113|pmid=11175741|url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3605706/pdf/emss-52373.pdf|accesso 7 luglio 2013}}</ref>

=== Inibizione dell'assemblaggio del pre-RC mediata dalla proteolisi di Cdt1 indipendente da CDK ===