Real time PCR: differenze tra le versioni

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Esso utilizza un RNA a sequenza specifica o una sonda basata su DNA per quantificare solamente il DNA contenente la sequenza della sonda; quindi, l'uso di una sonda rivelatrice incrementa significativamente la specificità, e permette la quantificazione regolare in presenza di prodotti di amplificazione non specifici (i coloranti fluorescenti, come ad esempio il SYBR Green, rivelano l'amplificazione di qualsiasi frammento di DNA). Un comune esempio è rappresentato dal metodo [[TaqMan]] e dai [[Faro molecolare|fari molecolari]].

In particolar modo, in base a questo metodo, la valutazione quantitativa dell'[[acido nucleico]] è affidata alla rilevazione e alla conseguente quantificazione di un "reporter" fluorescente il cui segnale cresce in maniera proporzionale alla quantità di prodotto di [[Reazione a catena della polimerasi|PCR]] nella reazione. A tal proposito viene disegnata la sonda gene-specifica che si appaia nella zona compresa fra i due primer (forward e reverse). Tale sonda, generalmente lunga 20-30 paia di basi, contiene un colorante fluorescente (''Reporter''), solitamente di colore verde, all'estremità 5' ed un colorante spegnitore (o ''[[Smorzamento (fluorescenza)|Quenchersmorzante]]''), di colore rosso, all'estremità 3'. In condizioni di normale appaiamento sonda-DNA stampo, se il campione viene irradiato, l'energia fluorescente emessa dal colorante ad alta energia in 5' viene assorbita totalmente dal quencher a bassa energia. Fino a quando, in altri termini, la sonda resta intatta la vicinanza tra reporter fluorescente e quencher annulla l'emissione del segnale di fluorescenza perché si verifica un trasferimento di energia dal primo al secondo. Nel momento in cui la [[DNA-polimerasi]], replicando lo stampo, incontra la sonda appaiata al suo interno, grazie alla sua attività esonucleasica 5' → 3', comincia a degradarla.

L'allontanamento tra il reporter ed il quencer pone fine all'attività di assorbimento di quest'ultimo e fa in modo che il reporter inizi ad emettere [[fluorescenza]]. Quest'ultima incrementerà a ogni ciclo proporzionalmente al tasso di degradazione della sonda. L'accumularsi del prodotto amplificato viene rivelato monitorando quindi l'incremento di fluorescenza del reporter.

Registrando la quantità di emissione fluorescente per ogni ciclo è possibile monitorare la reazione di polimerizzazione durante la sua fase esponenziale, nella quale il primo incremento significativo di prodotti neo-sintetizzati è collegato alla concentrazione iniziale di stampo nel campione. Infatti, maggiore è il numero di copie iniziali dell'acido nucleico, prima si osserverà un incremento significativo della fluorescenza.