Real time PCR: differenze tra le versioni

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* la progettazione di [[Primer|inneschi]];

* l'ottimizzazione degli stati di reazione.

Per alcuni geni bersaglio, le impostazioni degli inneschi e le condizioni ottimizzate sono state raccolte in alcuni database ([http://www.realtimeprimers.org/ http://www.realtimeprimers.org]) per facilitare lo sviluppo delle analisi. In una reazione tipica, il prodotto di PCR si raddoppia ad ogni ciclo dell'amplificazione. Siccome sono necessari parecchi cicli affinché abbastanza prodotto sia rilevabile, il diagramma della fluorescenza sul numero dei cicli esibisce un andamento sigmoide. Nei cicli finali, i substrati di reazione iniziano a scarseggiare, i prodotti di PCR non raddoppiano e la curva comincia ad appiattirsi. Il punto sulla curva in cui la quantità di fluorescenza comincia ad aumentare velocemente, solitamente alcuni scarti quadratici medi sopra la linea di base, è chiamato il ciclo soglia (valore di Ct). Il diagramma di Ct su DNA stampo è lineare, così un confronto dei valori di Ct fra reazioni multiple permette di calcolare la concentrazione dell'acido nucleico che si vuole quantificare. La [[Coefficiente angolare|pendenza]] di questa linea fornisce inoltre una misura dell'efficienza della PCR. Alcuni strumenti permettono agli utenti di generare delle curve di [[denaturazione del DNA|melting]] che seguono il completamento della PCR. Le curve di melting forniscono un'indicazione della purezza del prodotto di reazione e rivelano la presenza di [[Dimero|dimeri]] degli inneschi.

==Marcatura fluorescente==

Può essere effettuata attraverso l'uso di due diverse tecnologie:

*Intercalanti fluorescenti, ovvero molecole che si insinuano in qualche modo nella [[doppa elica|doppa elica di DNA]] e donano una colorazione visibile in fluorescenza

*Sonde fluorescenti, ovvero costrutti [[oligonucleotide|oligonucleotidici]] sintetici in grado di donare selettivamente la fluorescenza ai segmenti amplificati

=== Intercalanti fluorescenti ===

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In particolar modo, in base a questo metodo, la valutazione quantitativa dell'[[acido nucleico]] è affidata alla rilevazione e alla conseguente quantificazione di un "reporter" fluorescente il cui segnale cresce in maniera proporzionale alla quantità di prodotto di [[Reazione a catena della polimerasi|PCR]] nella reazione. A tal proposito viene disegnata la sonda gene-specifica che si appaia nella zona compresa fra i due primer (forward e reverse). Tale sonda, generalmente lunga 20-30 paia di basi, contiene un colorante fluorescente (''Reporter''), solitamente di colore verde, all'estremità 5' ed un colorante spegnitore (o ''[[Smorzamento (fluorescenza)|smorzante]]''), di colore rosso, all'estremità 3'. In condizioni di normale appaiamento sonda-DNA stampo, se il campione viene irradiato, l'energia fluorescente emessa dal colorante ad alta energia in 5' viene assorbita totalmente dal quencher a bassa energia. Fino a quando, in altri termini, la sonda resta intatta la vicinanza tra reporter fluorescente e quencher annulla l'emissione del segnale di fluorescenza perché si verifica un trasferimento di energia dal primo al secondo. Nel momento in cui la [[DNA-polimerasi]], replicando lo stampo, incontra la sonda appaiata al suo interno, grazie alla sua attività esonucleasica 5' → 3', comincia a degradarla.

L'allontanamento tra il reporter ed il quencerquencher pone fine all'attività di assorbimento di quest'ultimo e fa in modo che il reporter inizi ad emettere [[fluorescenza]]. Quest'ultima incrementerà a ogni ciclo proporzionalmente al tasso di degradazione della sonda. L'accumularsi del prodotto amplificato viene rivelato monitorando quindi l'incremento di fluorescenza del reporter.

Registrando la quantità di emissione fluorescente per ogni ciclo è possibile monitorare la reazione di polimerizzazione durante la sua fase esponenziale, nella quale il primo incremento significativo di prodotti neo-sintetizzati è collegato alla concentrazione iniziale di stampo nel campione. Infatti, maggiore è il numero di copie iniziali dell'acido nucleico, prima si osserverà un incremento significativo della fluorescenza.

== Quantificazione ==

Si può effettuare una quantificazione assoluta delle concentrazioni di specifici RNA producendo una curva standard di calibrazione; in alternativa si può effettuare una quantificazione relativa rapportando la loro quantità rispetto a quella di un [[gene]] di controllo. La quantificazione assoluta può utilizzare dei campioni standard (DNA plasmidico o altre forme di DNA) la cui concentrazione assoluta sia nota. Si deve essere certi, tuttavia, che l'efficienza della PCR sia la stessa per i campioni noti e per quelli incogniti. Il metodo della quantificazione relativa è più semplice poiché richiede la quantificazione di geni di controllo o [[gene costitutivo |geni costitutivi ]] per normalizzare l'espressione del gene studiato. Tuttavia, la selezione dei geni di controllo adatti può causare problemi poiché possono non essere espressi ugualmente attraverso tutti i campioni incogniti. Ciò può essere risolto normalizzando le misure con un insieme di [[gene costitutivo|geni housekeeping]] per evitare tale problema di variabilità.

== Altri progetti ==