* [[Spaventapasseri (DC Comics)|Jonathan Crane/lo Spaventapasseri]]: è l'antagonista principale del gioco; dopo circa due anni di assenza è tornato, e ha stretto un'alleanza con altri supercriminali per eliminare definitivamente Batman, considerato da lui il responsabile di ciò che Killer Croc gli ha fatto nelle fogne del manicomio di Arkham. Inoltre, ha costretto alla fuga gli abitanti di Gotham City, minacciando di colpire la città con una nuova, devastante tossina. Lo scontro con Killer Croc lo ha cambiato sia esteticamente che psicologicamente: la sua faccia è ridotta quasi ad un teschio, il suo atteggiamento è diventato molto cupo e la sua parlata più lenta. Doppiatore: [[John Noble]] (inglese), [[Alberto Sette]] (italiano).
* [[Jason Todd|IlJason Todd/Cavaliere di Arkham]]: è l'antagonista secondario del gioco, è un misterioso individuo, alleato dello Spaventapasseri. Viene raffigurato come una versione militarizzata e criminale di Batman, proviene dal [[Venezuela]] e dispone di un imponente esercito di mercenari. In seguito, si scoprirà che sotto l'armatura si cela Jason Todd. Doppiatore: [[Troy Baker]] (inglese), [[Luca Ghignone]] (italiano).
* Il [[Joker]]: è l'antagonista terziario del gioco; morto in seguito agli eventi di ''Batman: Arkham City'', il suo corpo verrà cremato all'inizio del gioco. Apparirà a Batman come un'allucinazione causata dal suo sangue infetto trasfuso ad Arkham City combinato agli effetti della tossina dello Spaventapasseri alla ACE Chemicals. Il Joker è brevemente giocabile in una sessione ambientata in un suo "sogno" poco prima della fine del gioco, ma in una sessione poco precedente a questa si scontrerà con Batman nella sua mente, contando su un numero spropositato di sue copie con l'obiettivo di costringere Batman a farlo "uscire". Ciò rende anch'essa una Boss Fight. Doppiatore: [[Mark Hamill]] (inglese), [[Riccardo Peroni]] (italiano).
Nel corso del gioco, sono presenti quattro persone infettate dal sangue del Joker durante gli eventi di ''Batman: Arkham City'' (tra cui Batman), che ne sviluppano pian piano la personalità:
** Albert King: detto Goliath, è una delle persone che sono state infettate dal sangue del Joker, sviluppandone il lato idrofobo. Dopo esser stato liberato da Harley Quinn, verrà ucciso da Henry Adams in balia del sangue del Joker. Personaggio inedito. Doppiatore: Renzo Ferrini (italiano).
