Next Generation Sequencing: differenze tra le versioni
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{{Da correggere|Uso non conforme del maiuscolo e minuscolo, si veda [[Aiuto:Maiuscolo e minuscolo]]|biologia|marzo 2018}}
[[File:Cluster Generation.png|miniatura|281x281px|Il DNA si lega alla flow cell grazie alla complementarietà di sequenza. Le sequenze si piegano e si attaccano a un secondo oligo formando una struttura a ponte. A questo punto un primer sintetizza il reverse strand e come conseguenza i due filamenti si rilassano e si distendono. Il risultato è un cluster neoformato di DNA forward e reverse.]]
Con il termine '''Next Generation Sequencing''' (NGS)<ref>{{Cita pubblicazione|nome=Jorge S.|cognome=Reis-Filho|data=2009-01-01|titolo=Next-generation sequencing|rivista=Breast Cancer Research|volume=11|numero=3|pp=S12|accesso=2017-03-31|doi=10.1186/bcr2431|url=http://dx.doi.org/10.1186/bcr2431}}</ref> <ref>{{Cita pubblicazione|nome=Gert|cognome=Matthijs|data=2016-01-01|titolo=Guidelines for diagnostic next-generation sequencing|rivista=European Journal of Human Genetics|volume=24|numero=1|pp=2–5|lingua=en|accesso=2017-03-31|doi=10.1038/ejhg.2015.226|url=http://www.nature.com/ejhg/journal/v24/n1/full/ejhg2015226a.html|nome2=Erika|cognome2=Souche|nome3=Mariëlle|cognome3=Alders}}</ref> o ''sequenziamento in parallelo'' si indicano una serie di tecnologie che permettono di sequenziare grandi [[Genoma|genomi]] in un tempo ristretto, dell'ordine di settimane. La tecnologia più utilizzata per il NGS permette di leggere fino a
L’impiego di queste tecniche innovative permette, in un solo esperimento, di effettuare studi di vario genere tra i quali la caratterizzazione simultanea di genomi, individuazione di riarrangiamenti cromosomici bilanciati e sbilanciati, delezioni e copy number variations (CNV).
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Ad oggi per il NGS ci sono diverse tecniche che si basano su principi differenti.
▲'''2. LIFE TECHNOLOGIES''': «pH» sequencing, si basa sulla variazione del pH che avviene quando viene incorporato un nucleotide
▲'''3. ROCHE PARALLEL PYROSEQUENCING''' questo metodo è stato dismesso a partire dal 2015 perché era meno efficiente dei metodi basati sulla fluorescenza.
▲'''4. PACIFIC BIOSCIENCES SMRT''' (Single molecule, real time) questa tecnologia non è ancora matura
▲'''5. OxfOXFORD NANOPORE''' rappresenta il futuro e non è ancora disponibile per i laboratori.
Le tecniche di NGS permettono di sequenziare:
Tutti questi metodi necessitano della preparazione degli acidi nucleici che devono essere sequenziati. Questa preparazione è richiesta per avere l'acido nucleico puro, delle dimensioni corrette, pronto per essere sequenziato. Questo step di preparazione viene anche chiamato
Una DNA library è una collezione di frammenti di DNA identificare e selezionare i frammenti di DNA che li interessano per un ulteriore studio.
Nel caso di una NGS library tutti i frammenti che vogliamo sequenziare hanno delle sequenze aggiuntive. Nella figura è riportato un esempio che si basa sulla
=== Processo{{Dfh}} ===
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Se si vuole sequenziare un intero genoma è necessario frammentarlo e poi procedere con la preparazione di una library di cloni.
Se si vuole studiare l’epigenoma prima è necessario effettuare una
Nel target capture si sequenzia solo parte del genoma (ad esempio un gene candidato per una specifica patologia), in questo caso la NGS è molto utile se abbiamo un centinaio di geni candidati, diversamente da altre tecniche come la
;Estrazione del DNA
Il primo step è
;Frammentazione
Dopo l’estrazione degli acidi nucleici avviene la frammentazione o taglio del DNA, esistono tre metodi differenti di frammentazione:
▲o FRAMMENTAZIONE ENZIMATICA basata sull’utilizzo di trasposasi ingegnerizzate
▲o NEBULIZZAZIONE in questo caso Il DNA viene fatto passare attraverso piccoli fori applicando un’alta pressione
== Note ==
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