Metodo del biureto

Il metodo del Biureto è un metodo di determinazione delle sieroproteine di tipo chimico.

Riscaldando l'urea a 180°C si ottiene la condensazione di due molecole di urea che formano un composto detto biureto. Se il biureto viene posto in una soluzione alcalina contenente ioni rameici si ha la formazione di un complesso, di composizione non perfettamente conosciuta, di colore violetto: reazione indicata come reazione del biureto. Questa reazione non è specifica del biureto, ma gli ioni rameici in ambiente alcalino reagiscono con qualsiasi composto contenente due o più gruppi CONH₂, CH₂NH₂ o CSNH₂. La reazione quindi è negativa con gli aminoacidi e con i dipeptidi mentre è positiva con i polipeptidi, partendo dai tripeptidi e con le le proteine, visto che sono presenti più gruppi CONH₂. L'intensità del colore sviluppato è proporzionale al numero di legami peptidici interessati nella reazione ed è quindi utilizzabile come metodo particolarmente rapido e semplice, per la determinazione qualitativa delle sieroproteine e delle proteine in generale.

Storia del reattivo

Sono numerose le soluzioni che sono state proposte per il reattivo del biureto. Nel 1942 Kingsley propose un reattivo unico, particolarmente adatto a scopo clinico, nel quale il sale di rame era presente in bassa concentrazione in soluzione basica. Il reattivo aveva come svantaggio una limitata stabilità per la facile precipitazione dei sali rameici come Cu(OH)₂, idrossido rameico. Per stabilizzare il sale Weichselbaum, nel 1950, ha proposto un nuovo reattivo con tartrato di potassio, stabilizzante, e ioduro di potassio (KI) così che s'impedisse l'autoriduzione.

Principio

Le proteine in ambiente basico e in presenza di ioni Cu²⁺ formano un complesso colorato violetto che si misura, con lo spettrofotometro, a 520-550 nm.

Reattivi secondo Weichselbaum

1 - Rettivo del Biureto secondo Weichselbaum: reattivo concentrato.

Titolare una soluzione di NaOH 0,2 mol/l in acqua distillata priva di CO2 (NaOH 8g a litro).
In un pallone si sciolgono 45g di sale di Seignette (Tartrato sodico potassico) in 200ml di NaOH 0,2 mol/l. 
Si aggiungono 15g di solfato di rame pentaidrato (CuSO4 . 5H2O).
Dopo la dissoluzione si aggiungono 5g di ioduro di potassio e si porta a volume con NaOH 0,2 mol/l.
Reattivo stabile per 2-3 mesi a temperatura ambiente.

2 - Reattivo diluito.

Diluire il reattivo 1:3 con acqua distillata poi utilizzarlo.

3 - Siero di controllo del commercio a contenuto noto di proteine.

Procedimento

Bianco: 5 ml reattivo biureto; Siero di controllo: 5 ml reattivo biureto, 0,1 ml siero di controllo; Campione: 5 ml reattivo biureto, 0,1 ml siero campione.

Lasciare 30 min al riparo della luce. Misurare l'assorbanza del campione e del siero di controllo a 520-550 nm azzerando con il bianco.

Calcolo

proteine g/dl= (Abs campione : Abs siero di controllo) x P

P= proteine nel siero di controllo in g/dl