Fosfolipasi

Le fosfolipasi sono degli enzimi che idrolizzano i fosfolipidi.

Nei glicerofosfolipidi, i legami tra i residui degli acidi grassi (o residui acilici) in posizione C-1 e C-2 e il glicerolo sono idrolizzati dalle fosfolipasi A1 e A2 (PLA1, PLA2), rispettivamente. Il legame estere tra il glicerolo e il residuo fosfato in posizione C-3 è idrolizzato dalla fosfolipasi C (PLC), mentre il legame estere tra il gruppo fosfato e il residuo alcolico della testa polare è idrolizzato dalla fosfolipasi D.

Le sfingomieline sono idrolizzate dalle sfingomielinasi, che scindono il legame tra sfingosina e residuo fasfato, in modo simile a quanto accade per i glicerofosfolipidi con la PLC. I prodotti della idrolisi sono ceramide (composta sfingosina + acido grasso) e fosforilcolina.

Le fosfolipasi sono importanti per la produzione di cofattori lipidici per enzimi di membrana e di messaggeri intracellulari in risposta a svariati stimoli esterni e interni. I messaggeri di origine glicerofosfolipidica comprendono inositol-1,4,5-trisfosfato (IP3), diacilglicerool (DAG), acido arachidonico (AA, 20:4n-3) e liso-PAF (lyso-platelet-activating factor), che viene successivamente metabolizzato in PAF (1-0-alkil-2-acetil- -3-glicerol-3-fosfocolina), mentre dalla sfingomielina sono prodotte le ceramidi.

Fosfolipasi C (PLC)

Le PLC sono una famiglia di enzimi che catalizzano in modo selettivo l’idrolisi Ca2+-dipendente dei fosfatidil-inositoli di membrana: fosfatidilinositolo (PI), fosfatidilinositolo 4-fosfato (PIP), e fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PIP2). I glicerofosfoinositoli sono localizzati di preferenza nel foglietto citoplasmatico della membrana cellulare; sebbene tutti e tre le specie possano essere idrolizzate, la più importante è PIP2, anche se risulta la meno abbondante, costituendo meno del 10% di tutti i fosfatidil-inositoli e meno dell’1 % di tutti i fosfolipidi di membrana.

Le PLC sono enzimi citoplasmatici, costituiti da un unico polipeptide; il sito catalitico è interposto tra i siti di ancoraggio alla membrana: il dominio PH (pleckstrin homology), che lega l’enzima ai fosfatidilinositoli, e il dominio C2 (protein kinase C ___domain 2), che interagisce con i fosfolipidi in maniera Ca-dipendente. I prodotti dell’idrolisi sono diacilglicerolo (DAG) e inositolo-1,4,5-trifosfato (IP3).

Le PLC comprendono quattro membri, denominati beta, gama, delta e epsilon, che si caratterizzano per le differenti modalità di attivazione.

Tutte le PLC per idrolizzare PIP2 devono associarsi alla membrana cellulare ed in questo processo i dominio PH e C2 hanno un ruolo determinante. I domini PH mediano sia interazioni proteina-proteina che proteina-lipidi, rispettivamente con G beta-gamma e con PIP2/PIP3: il dominio PH della PLCgamma si lega a PI(3,4,5)P3, quello della PLCdelta interagisce con PIP2, mentre quello della PLCbeta mostra minore specificità, ma interagisce anche con G beta-gamma. I domini C2 legano ioni Ca2+ e consentono l’ancoraggio Ca2+-mediato alla membrana, in quanto gli ioni Ca2+.stabiliscono legami elettrostatici con i fosfolipidi anionici, quali fosfatidilserina e fosfatidilinositoli.

Le PLCbetasono le uniche ad essere attivate direttamente dalle proteine GL’attivazione è avviata dai recettori “seven pass” accoppiati alle proteine G etrotrimeriche ed è dovuta alla diretta interazione delle fosfolipasi con le subunità G alfa e G beta-gamma. Quindi, le subunita G alfa e G beta-gammamediano sia l’attivazione che l’ancoraggio delle PLCbeta alla membrana. Gli isoenzimi beta1 e beta3 sono ubiquitari, mentre beta2 è limitato alle cellule emopoietiche e beta4 è espresso di preferenza nella retina.

Gli isoenzimi PLCgamma possiedono domini SH2 (Src homology 2) e sono attivati dalla tirosinfosforilazione da parte di tirosinchinasi recettoriali e non recettoriali (es. Src). In seguito alla attivazione dei recettori con attività tironchinasica intrinseca, le PLCgammasi legano con i propri domini SH2 ai residui autotirosinfosforilati dei recettori attivati. Questa interazione provoca la tirosinfosforilazione e conseguente attivazione delle PLCgamma. Nel frattempo, anche la IP-3-chinasi si lega con i suoi domini SH2 al recettore attivato e converte PIP2 in PIP3. Le PLCgamma fosforilate possono allora ancorarsi al PIP3 di membrana e idrolizzare PIP2.

L’attivazione delle PLC è uno dei primi eventi della risposta cellulare alla stimolazione da parte di un gran numero di segnali extracellulari. Grazie al loro intervento la risposta cellulare si separa in due vie, regolate dai secondi messaggeri DAG e IP3. Il DAG rimane localizzato sulla membrana, così da mediare l’associazione della proteinchinasi C (PKC) alla membrana cellulare, seguita dalla sua attivazione, mentre IP3 è un messaggero intracellulare citoplasmatico, che interagisce con il corrispondente recettore del reticolo endoplasmatico liscio causando la liberazione del Ca2+ immagazzinato e, quindi, l’innalzamento della concentrazione del Ca2+ intracellulare.

Infine, la stessa riduzione di concentrazione di membrana di PIP2 rappresenta di per sé un segnale per la modulazione dell’attività di diverse proteine. PIP2 è un cofattore per la PLD, è un substrato per la fosfoinositol-3-kinase (PI-3-kinase), modula la polimerizzazione dei filamenti di actina, interagendo con varie proteine leganti l’actina (ABP,actin-binding proteins), quali profilina, cofilina e gelsolina, costituisce un sito di attacco per le numerose proteine che contengono domini PH (pleckstrin homology) ed infine interagisce coa alcune proteine/enzimi coinvolti nel traffico vescicolare, incluse PLD e il fattore ADP-ribosilazione.

Fosfolipasi A2 (PLA2)

Le PLA2 costituiscono una grande famiglia di enzimi lipolitici, che catalizzano l’idrolisi del legame estere tra l’acido grasso in posizione 2 ed il glicerolo dei fosfolipidi. Si distinguono tre classi appartenenti a questa famiglia: PLA2 secretorie (sPLA2), PLA2 citosoliche (cPLA2) e PLA2 Ca+2 indipendenti.

Le sPLA2 o PLA2 a basso peso molecolare (p.m. 14-18 Kda) sono enzimi secreti dal pancreas o presenti nei liquidi biologici (liquido sinoviale, essudati) e nel veleno dei serpenti (vipera, cobra, serpente a sonagli).

Le cPLA2 sono enzimi citoplasmatici ad alto p.m. (80-110 Kda). La liberazione intracellulare di acido arachdonico (AA) indotta dai recettori è mediata principalmente dalla cPLA2, perché questa forma idrolizza di preferenza fosfolipidi contenenti AA. AA è il precursore della sintesi degli eicosanoidi, una rilevantissima classe di mediatori, che comprende prostaglandine, trombossano, leucotrieni e lipossine.

L’attivazione della PLA2 avviene in risposta alla formazione di messaggeri intracellulari, per cui non si verifica un rapporto così diretto con l’attivazione recettoriale come accade per le PLCbeta. La cPLA2 è regolata dalla concentrazione intracellulare di Ca+2 e dalla fosforilazione da parte della MAPK (mitogen-activated protein kinase). Concorre alla stimolazione della fosfolipasi anche la proteina regolatrice PAP (PLA2-activating protein).

La sensibilità della PLA2 al Ca+2 è dovuta alla presenza nella molecola di domini C2. In risposta all’aumento del Ca+2 intracellulare, la PLA2 migra dal citoplasma alle membrane del nucleo e del reticolo endoplasmatico, grazie alla interazione dei domini C2 con i fosfolipidi di membrana. Il Ca+2 legato a C2 si comporta da ponte molecolare tra la PLA2 e i fosfolipidi anionici e soprattutto neutralizza le loro cariche negative, permettendo interazioni idrofobiche tra il dominio C2 e le membrane endocellulari.

Altri enzimi coinvolti nella produzione di eicosanoidi sono localizzati sulle membrane interne, in particolare ciclossigenasi, 5-lipossigenasi, 5-lipoxygenase activating protein (FLAP) e leucotiene C-sintetasi.

I glucocorticoidi debbono parte della propria azione antinfiammatoria alla inibizione della trascrizione di cPLA2 e alla stimolazione della produzione di lipocortina 1, una proteina che inibisce la cPLA2.