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Short interfering RNA

tipo di ncRNA
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Uno small interfering RNA (o short interfering RNA, traducibile come breve RNA interferente), comunemente conosciuto come siRNA, è una molecola di RNA lunga tra i 20 ed i 25 nucleotidi in grado di svolgere numerosi ruoli biologici.

Più precisamente, gli siRNA sono coinvolti anzitutto nel pathway della RNA interference, che conduce alla inibizione dell'espressione di singoli geni. Hanno un ruolo importante anche in altri processi legati alla RNAi, come alcuni meccanismi antivirali o nel modellamento della struttura della cromatina.

Il meccanismo esatto di tutti questi processi sta avendo solo in questi ultimi anni una caratterizzazione completa ed esaustiva. Gli siRNA furono inizialmente individuati dal gruppo di ricerca di David Baulcombe a Norwich, come attori principali nel cosiddetto silenziamento genico post-trascrizionale nelle piante [1]. Successivamente, nel 2001, siRNA sintetici sono stati utilizzati per indurre RNAi in cellule di mammifero da parte del gruppo di ricerca di Thomas Tuschl[2]. Queste scoperte hanno portato ad un interesse crescente per la RNAi e le sue possibili applicazioni in ricerca ed in clinica.

Struttura

 
In una tipica molecola di siRNA i 19 nucleotidi centrali sono appaiati, mentre i due posti all'estremità sono sporgenti

Gli siRNA hanno una struttura ben definita, che consiste in un breve RNA a doppio filamento (RNAds), composto solitamente di 21 nucleotidi, con due nucleotidi sporgenti ad ognuna delle due estremità 3'. Questa struttura è il risultato del processamento dell'enzima Dicer, che converte lunghe molecole di RNAds o shRNA (molecole di RNA che formano una forcina) in siRNA [3]. Gli siRNA possono essere introdotti artificialmente dall'esterno attraverso specifici metodi di trasfezione, per indurre il silenziamento di geni specifici. In linea teorica, qualsiasi gene la cui sequenza sia nota può essere scelta come bersaglio di un siRNA. Questo ha reso gli siRNA uno strumento importante per studi sulla funzione genica e sullo sviluppo di nuovi farmaci.

Induzione di RNAi attraverso siRNA o suoi precursori

 
L'enzima Dicer

La trasfezione di un siRNA esogeno può essere problematico, dal momento che il silenziamento genico è solo transiente, soprattutto in cellule a rapida crescita. Una modalità per superare questo problema consiste nell'introduzione nella cellula bersaglio di un vettore (come un plasmide) in grado di esprimere la molecola di siRNA desiderata. Ciò è possibile attraverso il design di vettori in grado di produrre molecole di RNAds contenenti una forcina (chiamati shRNA, small hairpin RNA): tali molecole hanno il vantaggio di essere trascritte esattamente come ogni altro RNA. Questi vettori sono infatti in grado di trascrivere gli shRNA attraverso promotori eucariotici specifici per la RNA polimerasi III (come U6 o H1), che solitamente inducono la trascrizione dei piccoli RNA nucleari (o snRNA, dall'inglese small nuclear RNA) coinvolti nello splicing. H1 is the RNase component of human RNase P). Gli shRNA risultanti dalla trascrizione vengono processate a siRNA dalla RNAsi Dicer, anche il reale coinvolgimento di Dicer in questo passaggio non è ancora confermato dall'intera comunità scientifica[4].

Specificità degli siRNA

La RNAi si interseca con diversi altri processi cellulari. Non è dunque sorprendente che l'introduzione di siRNA nella cellula possa indurre alcuni effetti non specifici. Una cellula di mammifero, ad esempio, può interpretare una molecola di RNAds come un composto di origine virale, avviando una risposta immunitaria[5]. Inoltre, dal momento che i microRNA (molecole prodotte dalla cellula per regolare l'espressione genica) sono estremamente simili come struttura ai siRNA, sono possibili indesiderate interferenze anche con questo pathway.

Immunità innata

L'introduzione di troppo siRNA può generare diverse risposte cellulari aspecifiche in grado di attivare una risposta immunitaria innata. La maggior parte dei lavori scientifici sembra indicare che ciò sia dovuto alla presenza di PKR [6], un sensore cellulare per gli RNAds, e sembra probabile il coinvolgimento anche del gene RIG-I (acronimo di retinoic acid inducible Gene I). Un metodo promettente per ridurre l'effetto aspecifico consiste nell'adattare gli siRNA fino a far assumer loro la struttura di un microRNA. Dal momento che la presenza citosolica dei microRNA è assolutamente naturale e comporta uno dei più potenti meccanismi di silenziamento cellulare, tale approccio promette di essere molto efficace, permettendo di incorporare minori concentrazioni di siRNA per avere un silenziamento molto più efficiente e selettivo.

Bersagli errati

Si è riscontrato che alcuni mRNA non perfettamente complementari con la molecola di siRNA somministrata possono comunque andare incontro a degradazione[7]. Questo comporta ulteriore aspecificità di azione degli siRNA. Questo problema, in ogni caso, può essere superato attraverso un oculato design dei siRNA. La costruzione di siRNA ottimizzati per ottenere la massima specificità viene comunemente svolta con il supporto di algoritmi in grado di selezionarne la composizione migliore. I numerosi studi in corso sull'espressione genica e sulle caratteristiche del trascrittoma stanno attualmente permettendo di raffinare tali algoritmi.

Prospettive future

La possibilità di silenziare in teoria qualsiasi gene attraverso la RNAi indotta da siRNAs sta suscitando un grande interesse nella comunità scientifica così come dell'industria farmaceutica e biotecnologica.

siRNA nella ricerca di base

L'utilizzo di siRNA e relativi shRNA per silenziare specifici geni sta diventando un utile strumento di silenziamento genico per la ricerca di base. Rimangono tuttavia diversi problemi ancora da superare. Anzitutto, i siRNA mostrano una differente efficacia in differenti tipi cellulari, apparentemente indiscriminatamente (non è infatti possibile definire precisamente se un tipo cellulare sia responsivo ai siRNA oppure no). Rimane in ogni caso il problema delle risposte cellulari aspecifiche, ancora poco comprese. Finchè queste due questioni non saranno comprese a fondo e risolte, non sarà possibile la produzione di farmaci ad acidi nucleici pienamente affidabili.

siRNA nella ricerca farmaceutica

Viste le potenzialità dell'intervento farmacologico sui mRNA, hanno avuto inizio numerosi screening sul trascrittoma, così come numerosi test di funzionalità di numerosi siRNA. Dal momento che i processi patologici dipendono solitamente dall'espressione sregolata di diversi geni, infatti, ci si attende che la somministrazione di siRNA sia in grado di spegnere tale espressione (attraverso la RNAi); ciò potrebbe comportare un sensibile miglioramento delle terapie palliative attualmente utilizzate. La fase I dei trial clinici di due farmaci a RNA (in particolare per il trattamento per la degenerazione maculare) sta in effetti dimostrando che i siRNA sono ben tollerati e mostrano una buona efficacia. I siRNA e la relativa induzione di RNAi, dunque, promettono di dar vita ad una nuova importante classe di farmaci

Voci correlate

Note

  1. ^ (EN) Hamilton AJ, Baulcombe DC, A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants, Science. 1999 Oct 29;286(5441):950-2
  2. ^ (EN) Elbashir SM et al, Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8
  3. ^ (EN) Emily Bernstein et al, Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 409, 363-366 (18 January 2001)
  4. ^ (EN) Kim DH et al Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nature Biotechnology 23, 222 - 226 (2004)
  5. ^ (EN) Sledz CA et al RNA interference and double-stranded-RNA-activated pathways. Biochem. Soc. Trans.. (2004) 32, (952–956)
  6. ^ (EN) Zhang Z et al siRNA binding proteins of microglial cells: PKR is an unanticipated ligand. J Cell Biochem. 2006 Apr 15;97(6):1217-29
  7. ^ (EN) Birmingham A et al 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets Nature Methods 3, 199 - 204 (2006)

Bibliografia

Collegamenti esterni

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