ELISA (biochimica)
ELISA è un acronimo che è derivata dall'espressione in inglese Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima). Si tratta di versatile metodo d'analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di una sostanza usando uno o più anticorpi ad uno dei quali é legato un enzima. La sostanza da rilevare puo essere un antigene appartenente ad un patogeno od una molecola più piccola, chiamata aptene, come per esempio per riconoscere la presenza di steroidi. Se invece di un enzima, un radionucleide (spesso l'iodio-125) viene usato per rilevare la positività del test, si parla di RIA dall'inglese (radio-immuno assay).
Il saggio ELISA trova anche ampio uso per accertare la presenza di anticorpi contro un determinato antigeno nel plasma sanguigno del paziente per accertarsi se c'è stata una esposizione ad un determinato patogeno. Questo avviene nel test per l'HIV per accertarsi se il sistema immunitario del soggetto si è trovato a confronatre il virus dell'AIDS.
Ci sono diversi varianti del test ELISA. Che si differenziano secondo il componente che si vuole rilevare. Nel test diretto viene determinata la presenza dell'antigene, in quello indiretto, la presenza di anticorpi contro l'antigene. Il saggio puo essere competitivo (ELISA COMPETITIVO) o no (ELISA NON COMPETITIVO). L'ELISA NON COMPETITIVO diretto si effetua secondo diverse metodiche: semplice e sandwich ELISA.
Nel metodo semplice l'antigeno è assorbito sulla placca e rilevato con un anticorpo marcato da un enzima. Nel medodo a sandwich l'anticorpo che è usato per catturare l'antigene é assorbito sulla placca, gli anticorpi assorbiti sono in sequito esposti al fluido che potrebbe contenere l'antigene ed un secondo anticorpo, marcato viene aggiunto per rilevare che l'antigeno è stato catturato. In questo secondo caso, gli epitopi sull'antigeno dei due anticorpi devono essere completamante distinti senza alcuna sovraposizione.
Metodo diretto
Il metodo diretto (chiamato anche Sandwich) prevede la copertura del fondo del pozzetto con un anticorpo specifico per l'antigene che vogliamo misurare. Si esegue un lavaggio. In seguito si introduce l'antigene, che si legherà all'anticorpo. Si lava ulteriormente per togliere antigeni in eccesso. Si introduce un anticorpo specifico che legherà il complesso anticorpo+antigene, formando un triplo strato da cui prende il nome il test. All'ultimo anticorpo che abbiamo aggiunto, era legato un enzima specifico, e aggiungendo il suo substrato si formerà un prodotto colorato, che evidenzierà il pozzetto.
le fasi in sintesi prevedono:
- Immissione di una soluzione dell'anticorpo primario, specifico per l'antigene da ricercare ed individuare nel siero o in un dato liquido biologico, nei pozzetti di una apposita piastra da saggio in polistirene. Il fondo del pozzetto viene saturato con l'anticorpo che aderisce al fondo dei pozzetti e l'eccesso viene lavato via.
- Aggiunta, in soluzioni con diverse concentrazioni non note, dei campioni dei quali bisogna saggiare la presenza, o meno, dell'antigene caratteristico dell’organismo patogeno e lavaggio con soluzione tampone; L'antigene, se presente, si lega specificamente con l'anticorpo e l'eccesso viene lavato via.
- Aggiunta dell'anticorpo secondario, che può essere rappresentato da un anticorpo anti-immunoglobiline umane, che possono essere ottenute da animali di grossa taglia inoculando in essi siero umano(le cui proteine sono riconosciute come antigeni estranei al sistema immune dell'animale e quindi determinano la formazione di anticorpi). Questo anticorpo viene coniugato con un enzima, tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina, e lavaggio con soluzione tampone; L'anticorpo secondario si lega selettivamente all'antigene, se presente, e l'eccesso viene lavato via. L’assenza dell’antigene specifico per l’anticorpo comporta che l’anticorpo secondario (e il relativo enzima ad esso coniugato), con il lavaggio, venga dilavato.
- Aggiunta di p-nitrofenilfosfato; Questa sostanza provoca una reazione con l'enzima coniugato all'anticorpo secondario producendo p-nitrofenolo di colore giallo. Se l’antigene caratteristico dell’organismo patogeno è assente nel pozzetto non vi sarà neanche l’enzima coniugato all’anticorpo secondario - la reazione non può avvenire.
- Aggiunta di idrossido di sodio per bloccare la reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato;
- Lettura del risultato, espressione della reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato che produce sul substrato una reazione cromogenica o fluorogenica - ovvero sviluppo di colore o luce di fluorescenza - successivamente misurabile attraverso uno spettrofotometro.
Lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dell'antigene che si voleva saggiare e l'intensità della colorazione, misurabile grazie al spettrofotometro, è semi-quantitativa secondo una scala arbitraria di intensità.
Al fine di validare il test, le operazioni sopra riportate vengono effettuate in due pozzetti distinti che differiscono per il tipo di anticorpo primario che viene introdotto inizialmente: un pozzetto viene riempito con l'anticorpo specifico per l'antigene che si vuole individuare, mentre l'altro viene saturato con un anticorpo non specifico. Affinché il test possa ritenersi valido, in primo luogo deve risultare negativo in quest'ultimo pozzetto e nel caso in cui il campione biologico saggiato contenga realmente l'antigene d'interesse, il test deve essere positivo nell'altro pozzetto, quello saturato con l'anticorpo primario specifico.
Il test ELISA NON COMPETITIVO è un test qualitativo e semi-quantitativo: non fornisce un valore effettivo ma afferma la presenza o l'assenza dell'analita. Il test ELISA COMPETITIVO è invece un test quali-quantitativo: fornisce un valore specifico con una deviazione standard.
Metodo indiretto
Il metodo indiretto invece, in via teorica, funziona così: innanzi tutto si copre il fondo del pozzetto con l'antigene specifico per l'anticorpo che vogliamo misurare. Si lava via l'eccesso per eliminare l'indesiderato. Si aggiunge il siero(campione) che si pensa contenga gli anticorpi per quell'antigene adsorbito al fondo del pozzetto. Si lava via l'eccesso ancora una volta. Si aggiunge un secondo tipo di anticorpo (marcato con un enzima), che legherà il complesso antigene(adsorbito)+anticorpo(del campione) se sono presenti gli anticorpi nel campione. Il secondo anticorpo è quindi un anti-anticorpo. Si effettua un lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legatisi al complesso (quelli combinati resistono invece al lavaggio). Infine si aggiunge il substrato dell'enzima con cui è stato marcato l'anti-anticorpo: un cambiamento di colore indica la presenza degli anticorpi nel siero (nel campione), visto che l'enzima usato agisce sul substrato modificandolo, in maniera che assorba la luce e risulti colorato.[1]
Ha lo scopo di ricercare specifici anticorpi in un dato liquido biologico avendo a disposizione antigeni a cui questi possano legarsi o, al contrario, per ricercare specifici antigeni avendo a disposizione anticorpi monoclonali che possano legarsi a questi ultimi.
In caso di esito positivo, per conferma si esegue il Western Blot.
Innovazioni
La Multiple & Portable ELISA (M&P ELISA) usa una conformazione innovativa della fase solida: un’astina di polistirene da cui protrudono 8 o 12 ogive. L’intera astina va introdotta direttamente nel campione da saggiare e tutti i passaggi successivi (lavaggi, incubazione in coniugato e incubazione in cromogeno) sono eseguiti semplicemente immergendo le ogive dell’astina - estratta dal campione dopo opportuna incubazione - in pozzetti di micropiastre o microstrip standard, pre-riempiti con le soluzioni e i reagenti. Gli importanti vantaggi sono:
- l’ astina introdotta nel campione ha le ogive sensibilizzate con reagenti differenti, in modo che in ciascun campione sia possibile la ricerca simultanea di differenti anticorpi e/o di differenti antigeni, per analisi multiple o per multi-screening;
- il volume del campione analizzato può essere aumentato per aumentare la sensibilità del test in campioni clinici (sangue, saliva, urine), alimentari (latte di massa, pool di uova) e ambientali (acqua);
- un’ogiva di ogni astina non è sensibilizzata e funge da controllo negativo, per valutare la specificità per tutti i test di ricerca di anticorpi e/o antigeni eseguiti nel campione in esame;
- non si deve effettuare la distribuzione dei campioni, dei coniugati e del cromogeno nei pozzetti di micropiastra o in microstrip; i lavaggi sono estremamente semplificati;
- la tecnologia innovativa consente la realizzazione di kit da laboratorio pronti all'uso e di kit portatili per analisi in campo (ambulatori, aeroporti, dogane, allevamenti).
Note
- ^ Stura, E.A., Muller, B.H., Michel, S., Jolivet-Reynaud, C., Ducancel, F., Crystal structure of human prostate-specific antigen (PSA) in a sandwich antibody complex., in J. Mol. Biol., vol. 414, n. 5, 9 December 2011, pp. 530-544, DOI:10.1016/j.jmb.2011.10.007.