Next Generation Sequencing
Con il termine Next Generation Sequencing (NGS)[1] [2]o “sequenziamento in parallelo” si indicano una serie di tecnologie che permettono di sequenziare grandi genomi in un tempo ristretto, dell'ordine di settimane.
L’impiego di queste tecniche innovative permette, in un solo esperimento, di effettuare studi di vario genere tra i quali la caratterizzazione simultanea di genomi, individuazione di riarrangiamenti cromosomici bilanciati e sbilanciati, delezioni e copy number variations (CNV).
Nello specifico le tecniche di NGS permettono di sequenziare:
DNA GENOMICO • Intero genoma (la sequenza completa - piccoli genomi) • Esoma (solo la parte di DNA trascritto in RNA, esoni) • Geni mirati • Ampliconi (solo prodotti PCR)
TRASCRITTOMA • RNA totale • mRNA • small RNA (<30 nt)
EPIGENOMA • ChIP-Seq (chromatin immunoprecipitation sequencing: DNA o RNA a cui sono legati specifiche proteine) • Metil-Seq (studio del pattern di metilazione del DNA, epigenetica)
PROCESSO
La procedura per arrivare al sequenziamento è diversa a seconda del materiale di partenza. Se si vuole sequenziare un intero genoma è necessario frammentarlo e poi procedere con la preparazione della library.
Se si vuole studiare l’epigenoma prima dobbiamo effettuare una ChIP e poi procedere con la preparazione della library. Nel target capture si sequenzia solo parte del genoma (ad esempio un gene candidato per una specifica patologia, in questo caso la NGS è molto utile se abbiamo un centinaio di geni candidati, diversamente da altre tecniche come la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)che in questo caso richiederebbe lo svolgimento di un esperimento per ogni singolo esone da analizzare.
FRAMMENTAZIONE
Dopo l’estrazione degli acidi nucleici avviene la frammentazione o taglio del DNA, esistono tre metodi differenti di frammentazione:
o FRAMMENTAZIONE FISICA basata sull'utilizzo di ultrasuoni
o FRAMMENTAZIONE ENZIMATICA basata sull’utilizzo di trasposasi ingegnerizzate
o NEBULIZZAZIONE in questo caso Il DNA viene fatto passare attraverso piccoli fori applicando un’alta pressione
- ^ Jorge S. Reis-Filho, Next-generation sequencing, in Breast Cancer Research, vol. 11, n. 3, 1º gennaio 2009, pp. S12, DOI:10.1186/bcr2431. URL consultato il 31 marzo 2017.
- ^ (EN) Gert Matthijs, Erika Souche e Mariëlle Alders, Guidelines for diagnostic next-generation sequencing, in European Journal of Human Genetics, vol. 24, n. 1, 1º gennaio 2016, pp. 2–5, DOI:10.1038/ejhg.2015.226. URL consultato il 31 marzo 2017.