Next Generation Sequencing

Con il termine Next Generation Sequencing (NGS)^{[1] [2]} o sequenziamento in parallelo si indicano una serie di tecnologie che permettono di sequenziare grandi genomi in un tempo ristretto, dell'ordine di settimane. La tecnologia più utilizzata per il NGS permette di leggere fino a 300 bp per frammento.

Il DNA si lega alla flow cell grazie alla complementarietà di sequenza. Le sequenze si piegano e si attaccano a un secondo oligo formando una struttura a ponte. A questo punto un primer sintetizza il reverse strand e come conseguenza i due filamenti si rilassano e si distendono. Il risultato è un cluster neoformato di DNA forward e reverse.

L’impiego di queste tecniche innovative permette, in un solo esperimento, di effettuare studi di vario genere tra i quali la caratterizzazione simultanea di genomi, individuazione di riarrangiamenti cromosomici bilanciati e sbilanciati, delezioni e copy number variations (CNV).

Il NGS viene anche definito come metodo “da estensione” perché la base viene identificata durante l’aggiunta alla catena nascente. In breve potremmo riassumere il processo partendo da DNA a singolo filamento, un primer, la DNA polimerasi e singoli nucleotidi marcati. Una volta iniziata la reazione di sintesi di DNA a doppio filamento, ogni volta che la DNA polimerasi inserisce un nucleotide sulla catena in allungamento, questo viene detectato immediatamente in quanto viene rilasciato un segnale di fluorescenza specifico per ognuno dei nucleotidi.

Ad oggi per il NGS ci sono diverse tecniche che si basano su principi differenti.

1. ILLUMINA: fluorescent sequencing
2. LIFE TECHNOLOGIES: «pH» sequencing, si basa sulla variazione del pH che avviene quando viene incorporato un nucleotide
3. ROCHE PARALLEL PYROSEQUENCING questo metodo è stato dismesso a partire dal 2015 perché era meno efficiente dei metodi basati sulla fluorescenza.
4. PACIFIC BIOSCIENCES SMRT (Single molecule, real time) questa tecnologia non è ancora matura
5. OxfOXFORD NANOPORE rappresenta il futuro e non è ancora disponibile per i laboratori.

Le tecniche di NGS permettono di sequenziare:

DNA GENOMICO

• Intero genoma (la sequenza completa - piccoli genomi)
• Esoma (solo la parte di DNA trascritto in RNA, esoni)
• Geni mirati
• Ampliconi (solo prodotti PCR)

TRASCRITTOMA

• RNA totale
• mRNA
• small RNA (<30 nt)

EPIGENOMA

• ChIP-Seq (Chromatin immunoprecipitation sequencing: DNA o RNA a cui sono legati specifiche proteine)
• Metil-Seq (studio del pattern di metilazione del DNA, epigenetica)

Tutti questi metodi necessitano della preparazione degli acidi nucleici che devono essere sequenziati. Questa preparazione è richiesta per avere l'acido nucleico puro, delle dimensioni corrette, pronto per essere sequenziato. Questo step di preparazione viene anche chiamato library preparation

Una DNA library è una collezione di frammenti di DNA identificare e selezionare i frammenti di DNA che li interessano per un ulteriore studio.

Nel caso di una NGS library tutti i frammenti che vogliamo sequenziare hanno delle sequenze aggiuntive. Nella figura è riportato un esempio che si basa sulla tecnologia Illumina. Queste sequenze vengono introdotte in ogni frammento mediante ligazione e ognuna di queste ha una funzione: P5 e P7 sono le due sequenze che vengono ancorate alla flow cell dove i frammenti vengono prima amplificati e poi sequenziati. Le sequenze in giallo e in azzurro sono le sequenze che permettono il sequenziamento vero e proprio. Degli index parliamo più avanti perché non sempre sono presenti e sono facoltativi.

Processo

La procedura per arrivare al sequenziamento è diversa a seconda del materiale di partenza.

Se si vuole sequenziare un intero genoma è necessario frammentarlo e poi procedere con la preparazione di una library di cloni.

Se si vuole studiare l’epigenoma prima è necessario effettuare una ChIP e poi procedere con la preparazione di una library di cloni.

Nel target capture si sequenzia solo parte del genoma (ad esempio un gene candidato per una specifica patologia), in questo caso la NGS è molto utile se abbiamo un centinaio di geni candidati, diversamente da altre tecniche come la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) che in questo caso richiederebbe lo svolgimento di un esperimento per ogni singolo esone da analizzare.

Estrazione del DNA

Il primo step è estrarre gli acidi nucleici dal materiale di partenza (vettore o genoma da cellula). A tal fine esistono in commercio dei kit.

Frammentazione

Dopo l’estrazione degli acidi nucleici avviene la frammentazione o taglio del DNA, esistono tre metodi differenti di frammentazione:

• FRAMMENTAZIONE FISICA basata sull'utilizzo di ultrasuoni
• FRAMMENTAZIONE ENZIMATICA basata sull’utilizzo di trasposasi ingegnerizzate
• NEBULIZZAZIONE in questo caso Il DNA viene fatto passare attraverso piccoli fori applicando un’alta pressione

Note

1. ^ Jorge S. Reis-Filho, Next-generation sequencing, in Breast Cancer Research, vol. 11, n. 3, 1º gennaio 2009, pp. S12, DOI:10.1186/bcr2431. URL consultato il 31 marzo 2017.
2. ^ (EN) Gert Matthijs, Erika Souche e Mariëlle Alders, Guidelines for diagnostic next-generation sequencing, in European Journal of Human Genetics, vol. 24, n. 1, 1º gennaio 2016, pp. 2–5, DOI:10.1038/ejhg.2015.226. URL consultato il 31 marzo 2017.