Microarray di DNA: differenze tra le versioni

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I '''microarray''' sfruttano una tecnica di ibridazione inversa, che consiste nel fissare tutti i segmenti di DNA (detti [[probe]]) su un supporto e nel marcare invece l'acido nucleico che vogliamo identificare (detto ''target''). È una tecnica che è stata sviluppata negli anni '90 e oggi permette l'analisi dell'espressione genica monitorando in una sola volta gli RNA prodotti da migliaia di geni.

Per studiare gli mRNA, essi vengono prima estratti dalle cellule, convertiti in [[DNA complementare|cDNA]], con l’usol'uso di un enzima chiamato [[transcrittasi inversa|trascrittasi inversa]] e allo stesso momento marcati con una sonda fluorescente. Quando si fa avvenire l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il [[DNA complementare|cDNA]] target, quest'ultimo rimarrà legato alla sonda e può essere identificato semplicemente rilevando la posizione dove è rimasto legato.

Le principali applicazioni dei microarray sono l'analisi dei polimorfismi SNP, il confronto di popolazioni di RNA di cellule diverse e l'utilizzo per nuove metodologie di sequenziamento del DNA, nonché per lo screening di sequenze senso e antisenso nella ricerca degli [[oligonucleotidi]] usati in campo farmaceutico.

Il segmento di DNA legato al supporto solido è noto come probe. In un array sono usati contemporaneamente migliaia di probe. Questa tecnologia è nata da una tecnica più semplice nota come [[Southern blot]]ting, dove frammenti di DNA attaccati ad un substrato sono testati da sonde geniche aventi sequenze conosciute. La misura dell’espressionedell'espressione genica mediante microarray ha un notevole interesse sia nel campo della ricerca di base che nella diagnostica medica, in particolare di malattie a base genetica, dove l’espressionel'espressione genetica di cellule sane viene comparata con quella di cellule affette dalla malattia in esame.

==Produzione==

I microarray possono essere fabbricati usando diverse tecnologie, come la stampa di micro solchi, con un particolare microspillo appuntito su una lastrina di vetro dove verrà attaccata covalentemente la sonda (probe) di materiale genetico ottenuta per clonazione sfruttando la tecnica PCR, ([[Litografia (elettronica)|fotolitografia]]); usando maschere preformate da ditte specializzate come ad esempio da Greiner Bio-One. [http://genomebiology.com/2004/5/8/R58].

Ogni singolo clone viene posizionato nell'esatta posizione sul vetrino da un robot. È evidente che questa tecnica richiede apparecchiature robotiche molto sofisticate.

Il nucleo dell'apparecchiatura è costituito da un "gruppo scrivente" che preleva uno o più campioni di cDNA mediante l'utilizzo di pennini e li trasferisce su vetrini per microscopio, il movimento è ovviamente controllato da un computer. Durante la deposizione il sistema di controllo del robot registra automaticamente tutte le informazioni necessarie alla caratterizzazione ede alla completa identificazione di ciascun punto della matrice. Una volta che la sonda è sul vetrino si effettua il ''processing'', il passaggio cioè in cui la sonda viene legata covalentemente al supporto attraverso una reazione innescata dall'irraggiamento con luce ultravioletta o incubando il vetrino a 80 °C per 2 h. Infine il cDNA viene reso a singola catena attraverso una [[denaturazione del DNA|denaturazione]] termica o chimica. Con questa tecnica però era possibile creare solo microarray a bassa densità (ovvero con poche sonde per mm quadrati).

I DNA microarray possono essere usati per individuare l'RNA che può essere o non essere tradotto in proteine. Gli scienziati chiamano questa analisi [[espressione genica|"analisi dell’espressione"]] o [[profilo d'espressione]]. Con la tecnologia dei microarray si possono avere decine di migliaia di risultati in pochissimo tempo. Per questo motivo questa tecnologia ha permesso notevoli accelerazioni in diversi campi di investigazione biochimico e biotecnologico.

L’usoL'uso di microarray per lo studio del profilo d’espressioned'espressione genetica è stato pubblicato per la prima volta nel 1995 (''[[Science (journal)|Science]]'') e il primo genoma eucariotico completato con analisi di microarray fu quello del ''[[Saccharomyces cerevisiae]]'' nel 1997 (''Science'').

===Array per fotolitografia===

In questo caso gli oligonucleotidi sono sintetizzati in sito, questa tecnica è stata utilizzata per la prima volta dall'Affymetrix, che ne detiene il brevetto. La tecnica per la produzione di questi chip è detta [[Litografia (elettronica)|fotolitografia]], con la quale è possibile sintetizzare molte migliaia di differenti oligonucleotidi sulla superficie di un vetrino.

Anche se questa tecnica di sintesi è molto accurata, la massima lunghezza degli oligonucleotidi che è possibile raggiungere è di 25 nucleotidi, ma oligonucleotidi di queste dimensioni non sono sufficienti a dare specificità al microarray, per questo servono almeno 3 oligonucleotidi che legano un gene, e altri 3 oligonucleotidi che presentano un mismatch che serviranno da controllo negativo. Per cui le analisi di un singolo gene richiedono lo studio di sei spot che devono avere come risultato: i tre oligonucleotidi corretti, positivi, mentre i tre oligonucleotidi con il mismatch, negativi.

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===Spotted microarrays===

Negli '''spotted microarrays''' (o ''' microarray a doppio canale'''), I probe sono oligonucleotidi, [[cDNA]] o piccoli frammenti prodotti con la tecnologia [[Reazione a catena della polimerasi|PCR]] corrispondenti a [[RNA messaggero|mRNA]]. Questo tipo di microarray sfrutta l’l'[[ibridazione di DNA]] con cDNA da due campioni comparati (es. paziente e controllo), che sono marcate con due differenti fluorofori. I campioni possono essere miscelati e ibridizzati in un singolo microarray e quindi analizzati, permettendo la visualizzazione dei geni up-regolati e down-regolati contemporaneamente. Con questa tecnica il livello assoluto dell’espressionedell'espressione genica non può essere apprezzata a pieno, ma il costo dell’analisidell'analisi è ridotto della metà.

[[immagine:Microarray-schema.gif|centre]]

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[[Immagine:Affymetrix-microarray.jpg|thumb|upright=0.9|Due Affymetrix chips]]

Nei '''Microarray di oligonucleotidi''' (o '''single-channel microarrays'''), i probe sono progettati per riconoscere parti di sequenze di mRNA conosciute o predette. Vi sono matrici microarray di tal specie commercializzate da numerose ditte specializzate come [[GE Healthcare]], [[Affymetrix]], or [[Agilent]], esse contengono oligonucleotidi importanti per alcune analisi di routine o addirittura grosse parti di genomi di vari esseri viventi; inoltre possono essere prodotte matrici ad hoc a richiesta al fine di soddisfare qualsiasi bisogno, per la ricerca o la diagnostica.

Array oligonucleotidici possono essere prodotti o per deposizione piezoelettrica dell’interadell'intera lunghezza dell’oligodell'oligo, o per sintesi in situ ([[Litografia (elettronica)|fotolitografia]]).

Array di oligonucleotidi lunghi sono composti da 60-meri (oligo costituiti da 60 basi) e sono prodotti con la tecnologia ink-jet printing su substrati di silicio. Array di oligonucleotidi corti sono composti da 25-meri or 30-meri e sono prodotti per sintesi fotolitografica su substrati di silicio (Affymetrix) o per deposizione piezoelettrica su matrici acrilammidiche (GE Healthcare). Più recentemente, la NimbleGen Systems ha sintetizzato nuove matrici, dette Maskless Array, che possono essere utilizzate in modo flessibile con numerosissimi oligonucleotidi test (probe): i nucleotidi che formeranno gli oligonucleotidi sono dei nucleotidi modificati che presentano un gruppo protettore fotolabile che, finché è presente, ne impedisce il legame all'oligonucleotide in crescita. Questo gruppo può essere allontanato con una fonte luminosa che permette ai nucleotidi di reagire. Si usano delle "maschere" per determinare quali nucleotidi in quale posizione devono essere attivati dalla luce. In questa maniera sequenze oligonucleotidiche specifiche possono essere costruite in posizioni predeterminate. Questa tecnica permette di preparare microarray ad alta densità.

Un array standard può contenere più di 390000 pozzetti test (spots). Nuovi array sono in studio per la ricerca nel campo biochimico (vie metaboliche) o per la diagnosi e la prevenzione in campo medico. In particolare questa tecnica è importante per l’analisil'analisi del genoma di soggetti con malattie genetiche o che sono soggetti a potenziali malattie familiari, come il diabete, malattie cardiovascolari o tumori familiari.

==Microarray di genotipi==

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DNA microarray possono essere usati per lo studio di genotipi.

Gli '''SNP microarray''' sono particolari DNA microarray che sono usati per identificare i così detticosiddetti tratti ipervariabili, ovvero quelle sequenze che variano da individuo a individuo nell’ambitonell'ambito della stessa specie adesso o in sottopopolazioni isolate geograficamente o socialmente. Array di oligonucleotidi corti sono usati per identificare il [[polimorfismo di un singolo oligonucleotide|polimorfismo di un singolo nucleotide]] ([[single nucleotide polymorphisms]]) (SNPs), che si pensano responsabili della variazione genetica e della suscettibilità individuale a manifestare determinate malattie. I DNA microarray possono essere usati anche per la genotipizzazione ([[genotyping]]), che trova impiego nella medicina forense ([[esame del DNA]]), nella diagnostica e in una nuova branca della farmacologia, la [[farmacogenomica]], che si propone di studiare la relazione tra diversità genetica e risposta ai farmaci, intendendo per risposta sia gli effetti terapeutici che quelli collaterali o avversi.

Questi SNP microarray sono usati per tracciare i profili di mutazione somatica nelle cellule tumorali. L’amplificazoneL'inserzione e la delezione a cui vanno soggette queste cellule possono essere investigate contemporaneamente ai microarray l’l'[[ibridazione genomica comparativa]].

==Microarray e [[bioinformatica]]==

=== Standardizzazione ===

La mancanza di standardizzazione negli array presenta un problema interoperativo nella [[bioinformatica]], che non può prescindere dallo scambio di dati ottenuti con tale tecnica. Diversi progetti [[open source|open-source]] si prefiggono di facilitare l’interscambiol'interscambio di dati ottenuti da array. Il "Minimum Information About a Microarray Experiment" ([[MIAME]]), standard XML base per la descrizione di esperimenti di microarray, è stato adottato da molti [[giornali scientifici]] come standard richiesto per l’accettazionel'accettazione di lavori che contengono risultati ottenuti attraverso analisi di microarray.

=== Analisi statistica ===

L’analisiL'analisi di DNA microarray propone numerosi problemi di carattere [[statistica|statistico]], compresa la [[Normalizzazione (statistica)|normalizzazione]] dei dati.

Analizzando il metodo dei microarray, pare evidente che il grande numero di geni presenti in un singolo array pone lo sperimentatore davanti a un problema di test multiplo: anche se è estremamente raro e casuale, ogni gene può dare un risultato falso positivo; un test effettuato su più geni è più sicuro che mostri un andamento scientificamente più probante. Una differenza fondamentale tra i microarray e gli altri metodi di analisi biomedici tradizionali sta nella dimensione dei dati. Studi che contengono 100 analisi per paziente per 1000 pazienti possono essere considerati vasti studi clinici. Uno studio microarray di media vastità comprende diversi migliaia di dati per campione su centinaia di campioni diversi.

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==Protein microarray==

Si ottengono utilizzando differenti [[proteina|proteine]], fissate su microarray, come sonde. I ''protein microarray'' sono usati per identificare le interazioni proteina-proteina o, ad esempio, per identificare i substrati delle proteine [[chinasi]] o ancora per identificare gli obiettivi di piccole molecole biologicamente attive.<br />

Le proteine più comunemente usate durante un protein microarray sono gli [[anticorpi]] monoclonali, dove gli anticorpi sono stampati sul vetrino e usati come sonde per rilevare le proteine del lisato cellulare. L'uso di anticorpi monoclonali però crea alcuni problemi, compreso il fatto che non esistono anticorpi per la maggior parte delle proteine. Più recentemente ci si sta spingendo verso altri tipi di molecole da usare come sonde, quali [[peptidi]] di piccole, medie e grandi dimensioni. Tuttavia, oggi gli anticorpi rappresentano ancora la sonda più efficace per i protein microarray.<br />

I protein microarray (detti anche ''biochip'', ''proteinchip'') sono utilizzati nelle applicazioni biomediche per determinare la presenza e/o la quantità di proteine in campioni biologici, ad esempio nel sangue. Anche se i protein microarray usano metodi di rilevazione simili ai DNA microarray, presentano un altro problema: le concentrazioni delle proteine in un campione biologico possono presentare molti ordini di grandezza di differenza da quelle degli mRNA. Di conseguenza, i metodi di rilevazione dei protein microarray devono avere una gamma molto più vasta di rilevazione. Comunque il metodo preferito di rilevazione è ancora quello per fluorescenza, poiché è sicuro, sensibile e può dare alte risoluzioni.

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* [[Affymetrix]]

* [[Agilent Technologies]]

* [[Applied Biosystems]] ([http://www.appliedbiosystems.com/ external link])

* [["ArrayIt" TeleChem International Inc.]] ([http://www.arrayit.com/ external link])

* [[BioMicro Systems, Inc.]] ([http://www.biomicro.com/ external link for the MAUI (MicroArray User Interface) Hybridization System])

* [[Biotecgen s.r.l.]] ([http://www.biotecgen.it external link])

* [[CombiMatrix]]

* [[Dolomite Microfluidics]] ([http://www.dolomite-microfluidics.com/ external link])

* [[Eppendorf (companyazienda)|Eppendorf]] ([http://www.eppendorf.com/int/index.php external link])

* [[Febit Biotech gmbh]]

* [[febit biotech gmbh]] ([http://www.febit.de/ external link])

* [[GE Healthcare]] (and formerly [[Amersham plc]])

* [[Genetix]]

* [[Genetix]] ([http://www.genetix.com/microarray/ external link])

* [[Greiner Bio-One]] ([http://www.greiner-bio-one.it/ external link])

* [[Illumina, Inc.]] ([http://www.illumina.com/ external link])

* [[Kreatech]] ([http://www.kreatech.com/ external link])

* [[Microgem s.r.l]] ([http://www.microtech.eu])

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* [[Micronit Microfluidics]]

* [[Nanogen, Inc.]] ([http://www.nanogen.com/ external link])

* [[Nanogen, Inc.]]

* [[NimbleGen]] ([http://www.nimblegen.com/ external link])

* [[NimbleGen]]

* [[Ocimum Biosolutions]] (and formerly [[MWG ARRAYS]]) ([http://www.ocimumbio.com/ external link])

* [[Roche Diagnostics]]

* [[SCHOTT Nexterion]] ([http://www.schott.com/nexterion/ external link])

* [[STMicroelectronics]] ([http://www.st.com/ external link])

* [[F.LLI GALLI G. &/ P.]]

* [[Microgem s.r.l]] ([http://www.microtech.eu])

== Voci correlate ==

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== Collegamenti esterni ==

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{{Biologia molecolare}}

{{Controllo di autorità}}

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